响应曲面法优化枳壳中柚皮苷与新橙皮苷的提取工艺及抗氧化研究

徐坤勇，郭建忠，颜 娟，韵国萍*

（1.张家口市第一医院 药学部，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院 药学部，河北 张家口 075000）

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实，味苦、辛、酸，性微寒，归脾、胃经。传统医学认为，枳壳具有行滞消胀、理气宽中的功效，可用于治疗胃下垂、子宫脱垂、痰饮内停、胀满疼痛、胸肋气滞、食积不化等症[1]。现代研究证明新橙皮苷和柚皮苷为枳壳中黄酮类成分的主要组成部分，是枳壳行滞祛痰和平喘理气的主要药理成分，具有抗肿瘤、抗过敏、抗菌、抗炎、抗微生物、抗基因突变、保护受损心肌、诱导甲状腺癌细胞凋亡等多种药理作用，在医学领域得到广泛应用[2-5]。目前对枳壳提取工艺的研究，主要有煎煮法、乙醇回流提取法、超声提取法等[6-8]，这些方法各有优劣。响应曲面法能准确表达考察指标与单因素之间的关系，可快速得出多因素影响的最佳工艺条件[9]。为了综合考察各种因素对枳壳提取工艺的影响，进而更好地控制枳壳提取物的质量，本研究以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率的综合评分为考察指标，对上述方法进行优选，在单因素试验的基础上，采用响应曲面法优选枳壳提取工艺，并研究其抗氧化活性，以期为该药材开发应用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；752 型紫外可见分光光度计（上海恒平科学仪器有限公司）；ME204E 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）。

1.2 药品与试剂

枳壳样品购自张家口市张垣中药饮片有限公司，经中国中医科学院中药研究所杜茂波博士鉴定符合2020 年版《中国药典》质量规定。柚皮苷对照品（纯度≥98%，重庆对照品科技有限公司，批号：110722-201312），新橙皮苷对照品（纯度≥97%，西安旭煌技术有限公司，批号：N-19020）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美国Sigma-Aldrich，批号：C10088334）；2, 2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，美国Sigma-Aldrich，批号：C10076253）；甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 柚皮苷、新橙皮苷含量测定

2.1.1 色谱条件 参考《中国药典》（2020 年版），Hypersil C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；波长：283 nm；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-水（18 ∶82）（用磷酸调节pH 值至3）；进样体积：10 μL；流速：

1.0 mL/min。见图1。

2.1.2 柚皮苷、新橙皮苷对照品溶液 分别取柚皮苷、新橙皮苷对照品40.01 mg、40.00 mg，精密称定，转移至50 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，补充甲醇至刻度，摇晃混匀，作为对照品储备液。使用时，精密量取对照品储备液2 mL，转移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，制成柚皮苷和新橙皮苷质量浓度均为160 μg/mL的对照品溶液，冷藏保存备用。

图1 柚皮苷及新橙皮苷HPLC Fig. 1 HPLC of naringin and neohesperidin

2.1.3 供试品溶液 取枳壳粗粉约0.2 g，精密称定，不同因素条件提取，提取液放冷后滤过，蒸发皿中蒸干，适量甲醇溶解并洗涤干净后转移至100 mL容量瓶中，超声，加甲醇至刻度，摇晃混匀，作为供试品储备液。使用时，移取储备液2 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，取500 μL 续滤液，即得。

2.1.4 阴性样品溶液 按“2.1.3”项下方法，分别制备不同因素提取条件下不含枳壳的溶液，即得。

2.1.5 线性关系考察 精密量取柚皮苷、新橙皮苷质量浓度均为800 μg/mL的混合对照品储备液适量，甲醇稀释，分别制成质量浓度为10、40、80、120、150、200 μg/mL 的对照品溶液，按上述色谱条件进行分析，记录峰面积。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程。柚皮苷为Y = 4.56×103X+3.34×104， r = 0.999 5，在10 ～200 μg/mL 范围呈良好线性关系；新橙皮苷为Y = 5.78×103X + 4.63×104，r = 0.999 6，在10 ～ 200 μg/mL 范围呈良好线性关系。

2.1.6 精密度考察 分别精密量取柚皮苷、新橙皮苷混合对照品溶液各10 μL，按上述色谱条件，连续进样6 次，记录各色谱峰面积，柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD 分别为0.51%和0.67%。结果表明，方法精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 分别精密量取“2.1.3”项下同一供试品溶液10 μL，分别于0、1、4、8、16、24 h按上述色谱条件测定，结果柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD 分别为1.01%和0.87%。说明供试品溶液在制备24 h 内稳定。

2.1.8 重复性试验 取同一批枳壳粗粉6 份，按“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样测定，结果柚皮苷、新橙皮苷的平均含量分别为7.38%、4.23%，RSD 分别为0.89%、1.11%。说明该方法的重复性良好。

(3)信息没办法保证真实。整个供应链金融中的交易信息有可能被篡改，交易中的信息后期无法保证真实。即使是根据贸易结果产生的应收、应付数据，也有造假的可能。因为信息不对称带来损失，银行后期回款带来压力。

2.1.9 回收率考察 取已进行含量测定的枳壳（含柚皮苷约为7.36%、新橙皮苷约为4.25%）粗粉6 份，每份约0.2 g，精密称定。分别加入柚皮苷、新橙皮苷标准品约14.72 mg、8.50 mg，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果见表1。柚皮苷、新橙皮苷的平均回收率分别为97.99%、97.73%，RSD 分别为2.15%、1.84%，说明该方法有较好的准确性。

表1 加样回收率试验（n = 6）Tab. 1 Result of recovery test（n = 6）

2.2 收膏率测定

参照《中国药典》（2020 年版）“浸出物测定法”项下方法测定。精密量取“2.1.3”项下供试品储备液20 mL，置于预先干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱干燥3 h 后取出，再置于干燥器中冷却至常温，立即称重，计算收膏率。

计算公式：

其中，W1为浸膏质量，g；W2为药物总质量，g。

2.3 枳壳提取工艺单因素考察

2.3.1 提取工艺评价指标的建立 以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率为评价指标，计算综合得分（Y），通过综合评分法优选枳壳的提取工艺，其中柚皮苷、新橙皮苷含量为主要指标，分别赋予50%、30%的权重；在实际生产中，收膏率常作为提取工艺控制指标之一，赋予20%的权重，得到最终评价指标[10]。公式如下：

2.3.2 提取方法考察 （1）煎煮法 取枳壳粗粉约2 g，精密称定，加20 mL 水，煎煮2 h，提取3 次，提取液按“2.1.3”项下方法处理后定容于1 000 mL容量瓶中。测定柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率，并计算综合得分，平行3 份，采用SPSS 22.0 软件进行数据差异显著性分析。结果见表2。

（2）乙醇回流提取法 取枳壳粗粉约2 g，精密称定，加20 mL 95%乙醇回流提取2 h，提取3 次，其余同煎煮法。见表2。

（3）超声提取法 取枳壳粗粉约2 g，精密称定，加20 mL 95%乙醇超声（400 W）提取2 h，提取3 次，其余同煎煮法。见表2。

表2 提取方法试验结果（±s，n = 3）Tab. 2 Result of extraction method test（±s，n = 3）

表2 提取方法试验结果（±s，n = 3）Tab. 2 Result of extraction method test（±s，n = 3）

注：与煎煮法比较，*P ＜0.05。

收膏率/%提取方法 柚皮苷含量/%新橙皮苷含量/%综合得分/%煎煮法 7.37±0.15 4.36±0.08 29.02±0.46 98.14±1.47乙醇回流提取法 7.48±0.19 4.44±0.11 27.46±0.51* 98.33±1.54超声提取法 7.57±0.24 4.42±0.13 27.41±0.48* 98.75±1.32 F 2.560 2.641 1.089 0.806 P 0.288 0.533 0.014 0.621

2.3.3 液料比的考察 取枳壳粗粉约2 g，精密称定，水煎煮2 h，提取3 次，考察液料比分别为4 ∶1、8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1、20 ∶1 时综合得分，平行3 份。结果见图2。当液料比增加时，综合得分先增大后减小，在液料比16 ∶1 时，综合得分最高，故选择液料比因素的中心点为16 ∶1。

图2 液料比对综合得分的影响Fig. 2 Effects of liquid-solid ratio on comprehensive score

2.3.4 提取时间的考察 取枳壳粗粉约2 g，精密称定，加20 mL 水，提取3 次，考察提取时间分别为0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h 时综合得分，平行3 份。结果见图3。当提取时间增加时，综合得分先增大后减少，当提取时间为2 h 时，综合得分最高，故选择提取时间因素的中心点为2 h。

2.3.5 提取次数的考察 取枳壳粗粉约2 g，精密称定，加20 mL 水，煎煮2 h，考察提取次数分别为1、2、3、4 次时综合得分，平行3 份。结果见图4。当提取次数为4 次时，综合得分最高，提取次数为3 次时综合得分略低于4 次，考虑提取效率和生产成本，选择提取次数因素的中心点为3 次。

图3 提取时间对综合得分的影响Fig. 3 Effects of extraction time on comprehensive score

图4 提取次数对综合得分的影响Fig. 4 Effects of extraction times on comprehensive score

2.4 Box-Behnken 响应面法优化枳壳提取工艺

2.4.1 响应面试验设计及结果 运用Design-Expert 8.0.6 软件设计响应面分析模型，在单因素考察的基础上，以液料比（A）、提取时间（B）及提取次数（C）为3 个因素。因素水平见表3。枳壳提取评价综合得分（Y）为响应值，设计Box-Behnken 分析模型试验组，优选提取工艺，试验设计及结果见表4。

表3 Box-Behnken 响应面试验因素水平Tab. 3 Box-Behnken response surface test factor level

2.4.2 模型建立及显著性检验 将表4 试验数据导入 Design Expert 8.0.6 软件进行回归分析。液料比（A）、提取时间（B）以及提取次数（C）对枳壳提取评价综合得分（Y）的二次多项回归模型为Y = 86.26 + 14.98 A + 0.95 B - 2.40 C + 0.53 AB-3.68 AC + 0.53 BC - 19.83 A2- 4.52 B2- 2.79 C2，对所得模型进行方差分析，考察其显著性。见表5。结果可知，模型P ＜0.001，表明所得模型具有极显著性；失拟项P = 0.104＞0.05，失拟项不显著；模型R2= 0.987 8，表明拟合程度好，试验方法可靠，该模型可用于枳壳提取工艺条件的预测和分析。由回归模型各项P 值可知，一次项A 因素对综合得分有极显著性影响，C因素对综合得分有显著性影响，B 因素影响不显著；交互项AC 因素对综合得分有显著性影响，AB、BC因素影响不显著；二次项A2、B2因素对综合得分有极显著性影响，C2因素影响不显著。由回归模型单因素F 值可看出，A 因素对综合得分影响最大，C 因素次之，B 因素最小。结合回归模型各因素P 值和F值可知，以综合得分为响应值时，各因素影响顺序为A ＞C ＞B。

表4 Box-Behnken 响应面试验设计及结果Tab. 4 Design and results of Box-Behnken test

表5 响应面模型方差分析结果Tab. 5 ANOVA for response surface quadratic model

2.4.3 响应面分析 通过 Design Expert 8.0.6 软件对试验数据回归模型进行分析，可得到反映各因素交互作用水平的二维等高线平面图及3D 曲面图。见图5 ～7。各因素交互作用水平可通过二维等高线平面图中等高线形状和3D 曲面图中曲面坡度进行分析，当等高线密集且呈椭圆形，表明交互作用强；当3D曲面图坡度大，陡峭时，说明影响显著[11]。由图6直观分析可知，等高线密集且呈椭圆形，3D 响应曲面陡峭，坡度较大，说明A 因素C 因素交互作用强，且影响显著。由图7 直观分析可知，等高线基本呈圆形而非椭圆形，且3D 响应曲面坡度平缓，说明B 因素和C 因素交互作用弱，且影响不显著。结果与方差分析一致。

图5 液料比与提取时间对综合得分影响的响应面图Fig. 5 Response surface diagram of the effect of liquid-to-material ratio and extraction time on comprehensive score

图6 液料比与提取次数对综合得分影响的响应面图Fig. 6 Response surface diagram of the effect of liquid-to-material ratio and extraction times on comprehensive score

图7 提取时间与提取次数对综合得分影响的响应面图Fig. 7 Response surface diagram of the effect of extraction time and number of extractions on comprehensive score

2.4.4 验证试验 通过 Design Expert 8.0.6 软件分析结果可知，当综合得分为最大值时，枳壳提取的工艺参数：液料比为18.05 ∶1，提取时间为1.79 h，提取次数为2.17 次，在此条件下，综合得分的预测值为88.00%。为便于实际生产操作，调整枳壳提取工艺参数为液料比18 ∶1，提取时间为105 min，提取次数为2 次。称取枳壳2 g，上述条件进行3 次平行试验，验证模型的合理性和工艺的可靠性。结果RSD 为0.65%，表明模型合理且工艺可靠。见表6。

表6 验证试验结果Tab. 6 Results of verification test

2.5 体外抗氧化活性研究

2.5.1 清除DPPH 自由基 取最优提取条件下不同质量浓度（柚皮苷与新橙皮苷总浓度）样品溶液各2 mL，分别加入到具塞试管中，加0.15 mmol/L DPPH溶液2 mL，振摇混匀。避光静置反应30 min，空白对照为95%乙醇，在波长517 nm 处测定其吸光度为A样品；95%乙醇与不同质量浓度柚皮苷、新橙皮苷溶液各2 mL 的混合液，测定其吸光度为A空白；95%乙醇与DPPH 溶液各2 mL 的混合液，测定其吸光度为A对照

[12]。平行三次，阳性对照为维生素C，计算清除率。

清除率（%）=［1-（A样品-A空白）/A对照］×100%

以清除率为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制工作曲线，计算对DPPH 清除率达到50%时的效应浓度IC50值。随着样品溶液质量浓度升高，清除率逐渐增大，但整体低于维生素C 清除率。枳壳提取液IC50值为29.54 mg/mL，表明枳壳提取液对DPPH自由基有一定的清除能力。结果见图8。

图8 DPPH 自由基清除率Fig. 8 DPPH free radical clearance rate

2.5.2 清除ABTS+自由基 参考文献[13]报道，取7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液各5 mL 制备ABTS+使用液。取最优提取条件下不同质量浓度（柚皮苷与新橙皮苷总浓度）样品溶液各0.4 mL，分别加入到具塞试管中，加ABTS+使用液3 mL，振摇混匀。室温（25 ℃）避光静置反应30 min，空白对照为95%乙醇，在波长732 nm 处测定其吸光度为A样品；以95%乙醇代替ABTS+使用液扣除样品溶液的本底吸收，测定的吸光度为A空白；用相同体积的95%乙醇代替样品溶液作为对照，测定其吸光度为A对照。平行三次，阳性对照为维生素C，计算清除率。

清除率（%）=［1-（A样品-A空白）/A对照］×100%

以清除率为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制工作曲线，计算IC50值。在样品浓度低于20 μg/mL时，枳壳提取液DPPH 清除率高于维生素C 清除率，枳壳提取液IC50值为22.54 μg/mL，表明枳壳提取液对ABTS+自由基的清除能力较强。结果见图9。

3 讨论

在中药新剂型研制过程中，提取工艺可直接影响中药提取效果，进而影响药物的疗效。为了使药效组分提取更充分，故选用多指标对枳壳提取工艺进行评价。枳壳药效成分主要为黄酮类物质，其中新橙皮苷和柚皮苷为含量比较高的两种成分，是枳壳的主要活性物质，也是《中国药典》（2020 年版）药材枳壳质量标准含量测定项下的指标成分；另外收膏率为评价中药提取工艺的重要指标之一[14]，故本研究以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率为综合评价指标对枳壳提取工艺进行优化。

图9 ABTS+自由基清除率Fig. 9 ABTS+ free radical clearance rate

优化中药提取工艺多因素参数时，响应值与各影响因素之间往往不具备线性关系。响应曲面法能通过考察各影响因素的交互作用，建立非线性回归模型，拟合最佳提取工艺，是一种应用广泛且预测性好、精度高的统计方法，近年来在优化中药提取工艺中得到广泛应用[15-17]。单因素的取值范围对响应曲面法拟合结果有较大影响，本研究首先通过单因素考察试验确定枳壳提取方法为煎煮法，后通过单因素对综合得分影响的考察试验，确定各因素的取值范围和中心点，在此基础上，采用响应曲面法设计试验优化枳壳提取工艺。得到极显著的二次多项回归模型，拟合度好，可用于预测枳壳提取柚皮苷和新橙皮苷含量。目前用于测定抗氧化活性的方法较多，本研究前期设计了铁离子还原力及邻苯三酚法抗氧化试验，试验中发现铁离子还原法程序繁杂、操作不便；邻苯三酚法重现性差，故最终选择清除DPPH 自由基和清除ABTS+自由基法测定抗氧化活性。

4 结论

本试验通过响应曲面法优选的最佳提取工艺条件：液料比为18 ∶1，提取时间为105 min，提取次数为2 次，在该条件下，综合得分为87.73%，与预测值接近。验证试验结果表明，优选工艺重复性好，可行性强。体外抗氧化活性研究结果表明，枳壳柚皮苷、新橙皮苷提取液对DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力。