新西兰兔骨缺损模型的文献综述△

艾子政，董谢平

（1江西省人民医院骨科，江西南昌 330006；2江西中医药大学研究生院，江西南昌 330004）

骨缺损可由感染、肿瘤、创伤和各种先天性疾病等引起［1］，常需植骨。由于自体骨移植和异体骨移植受到可用性、发病率或潜在风险（如免疫原性和疾病传播）等限制［2］，为此，近几十年来进行了大量人工骨替代物的研发。这些研发均需进行临床前的动物实验，而选择或建立合适的骨缺损动物模型是顺利完成动物实验的前提条件。新西兰白兔因其骨骼成熟时间短，廉价且易于饲养和处理，抗病能力较强，能够进行符合足够统计条件的研究等特点，成为世界上肌肉骨骼系统研究中使用最为广泛的实验兔品种［3-5］。

在骨缺损的实验中，不仅建立骨缺损模型的骨骼及其部位、类型、骨膜剥离情况和是否固定等外因对实验结果影响很大，新西兰兔的年龄、性别、体重和日常活动量等内因也会对实验产生较大的影响；但在以新西兰兔为实验动物制作骨缺损的文献报道中，有关上述因素的组合方式却大相径庭，没有相对公认的标准与通行做法，也鲜有对所述组合方式的原因进行说明者，影响了对研究结果的评价。为此，本文对上述因素进行综述，以期为新西兰兔骨缺损动物模型的设计或制作提供参考。

1 新西兰兔制备骨缺损模型的骨骼及部位

制备骨缺损模型的骨骼有四肢骨、颅骨和下颌骨等。颅骨不负重，对材料的力学性能要求低，故多用于填充型植骨材料的骨缺损模型制备；口腔存在易感染的特殊环境，故下颌骨缺损模型常用于口腔领域的实验材料研究。但由于有兔牙的存在，下颌骨可用骨质并不多，因此下颌骨与颅骨一样，骨缺损模型使用频率均较低。而四肢骨则因骨骼类型较多、骨量丰富、结构规则、能测试材料的负重性能和手术操作简单等优势，成为骨缺损实验优先选择的模型。

四肢骨包括前肢的肱、桡、尺骨以及后肢的股骨和胫骨，可分为负重骨和非负重骨。一般来说，独立构成肢体部位的单根长管状骨为负重骨，双骨结构部位的长管骨为非负重骨。但因兔在标准笼饲养时，上肢常抬起成蹲立位，肱骨受力机会减少，故可视为非负重骨；桡、尺骨共同构成兔前臂的支持结构，其中一骨制备骨缺损时，另一骨可起到支撑作用，自然属于非负重骨。作为后肢的兔胫腓骨在中下段融合为一体，骨结构成“Y”形，因胫骨缺损模型多选择在两骨融合点以下的单骨区域，故仍为负重骨。因此，通常将新西兰兔前肢骨视为非负重骨，后肢骨视为负重骨。

在四肢骨模型中制备骨缺损的部位一般选择长骨骨干和骨端。长骨骨干处骨骼形状规则，常用于制备节段性骨缺损；长骨骨端如股骨髁、肱骨大结节和胫骨近端内侧等处为松质骨结构，且骨骼相对粗大、血运丰富，常用于制备无需固定的圆柱形骨缺损。

2 新西兰兔骨缺损模型的种类

新西兰兔骨缺损模型种类有四肢骨骨缺损、颅骨缺损和下颌骨缺损几种模型［6］。四肢骨骨缺损根据缺损形状可分为骨干节段性缺损、部分皮质缺损或松质骨缺损。

骨干节段骨缺损模型（segmental bone defect,SBD）系在长骨干中段截除一段骨干所遗留的缺损，骨替代物填充后通常需用固定装置固定，以维持植骨替代物与断端之间的稳定性［7］。

部分皮质骨或松质骨缺损模型（partial cortical defect or cancellous bone defect,PC）是在骨端的一侧用小型电钻穿透皮质骨形成一个可延伸到下面松质骨或骨髓腔的孔，通常不破坏骨的连续性［7］。

颅骨缺损模型为保护颅骨深层硬脑膜前提下，用环钻钻孔并去除切下来的骨板所形成的圆盘形骨缺损。颅骨模型有以下特点：由于硬脑膜和皮肤提供支撑，不需要固定，骨再生不会受到动物活动的影响，但颅骨不负重，对材料的力学性能要求低，故此模型多用于测试填充型植骨材料。

新西兰兔的下颌骨模型在下颌骨的下颌体处造成部分厚度或全部厚度的骨缺损，部分厚度缺损包括去除下颌颊皮层和下面的牙根，保留完整的骨内膜和牙周膜作为再生干细胞的潜在来源，而全层缺损包括颊皮层、牙根和舌皮层的切除［8］。

在四肢骨模型中，桡骨干或尺骨干缺损虽为非负重骨模型，以桡骨干缺损模型为例，其不需固定器固定，但实验中尺骨可能因过度运动和负重导致骨折，长骨部分皮质骨或松质骨缺损模型对移植材料的力学性能要求较低，且制备的圆柱形缺损的大小容易受到该部位最小矢状面前后径或上下径大小的限制。

3 缺损大小的选择

实验动物在自然情况下不能自行愈合的最小尺寸的骨缺损即临界骨缺损或称骨极限缺损（critical size defect,CSD）［9］。有学者认为长管骨CSD的大小应为骨直径的1.5～2.5倍或骨长的十分之一［10］。为探寻不同骨骼不同部位的CSD值，骨干骨缺损模型一般将缺损处的骨膜和骨一并切除，圆柱形骨缺损模型的骨膜缺损通常比缺损空腔直径大2～3 mm。研究人员常以毫米为间隔设计连续或不连续数值的骨缺损尺寸，还有学者在骨修复材料实验中设立空白（缺损）组，从而研究CSD。目前绝大多数文献采用此方法研究得到的临界值如下。

SBD临界值：桡骨干 15 mm［11］、尺骨干 16 mm［12］、肱骨干 7 mm［13］、股骨干 15 mm［14］、胫骨干10 mm［15］；但是，去除胫骨全长骨膜的胫骨大段SBD则为12 mm［16］，3个月龄兔和完全保留骨膜的成年兔的桡骨干SBD临界值均为20 mm［17，18］；这些研究结果都是基于长管骨CSD的大小应为骨直径的1.5～2.5倍或骨长的十分之一的观点所做实验得出的［10］。PC临界值（直径×深度）：股骨髁6 mm×10 mm［19］；胫骨近端内侧 8 mm×6 mm［20］；肱骨大结节 10 mm×5 mm［21］。颅骨临界值：直径为 15 mm的圆形缺损［22］。下颌骨模型则常见制备成10 mm的圆孔状全层骨缺损［8］、10 mm×10 mm 的方孔状全层骨缺损［23］和12 mm×10 mm×2 mm（长×宽×深）方孔状去除部分厚度形成凹槽的骨缺损［24］。

也有学者采用非临界值进行骨缺损实验研究，如：胫骨PC模型在胫骨内侧近端一处同时制备两个不相连且等体积的圆柱形缺损［25］；颅骨模型在颅骨矢状缝两边各设计一个直径为8 mm的圆盘形骨缺损［26］。这样的设计具有节省实验资源，同种内环境下相互对照，便于相同时间节点定量分析骨缺损区域形成的组织，使实验结果更加客观等优点。

4 骨膜的处理

由于骨膜能为骨缺损部位提供营养物质和具有成骨潜能的干细胞，参与骨的自我修复，因此在骨干骨缺损模型制备过程中，骨膜是否去除及剥离程度对CSD值有一定的影响。潘朝晖等［18］将24只成年兔股骨干分别制造20 mm的骨缺损，并分为切除与截骨等长的骨膜和骨膜完全保留两组，术后12周可见切除骨膜组有骨痂生长，骨端部分硬化，但未形成骨性连接；保留骨膜组骨缺损处有均匀的新生骨连接两端，与缺损处两端宿主骨难以分辨，出现骨性愈合；提示保留骨膜能促进新生骨的形成，骨修复能力也更好。Zhang等［27］所进行的同种异体骨联合骨膜的骨修复实验结果显示，其修复能力与自体骨移植效果相当。

在截除一段骨干后对骨膜的处理主要有完全保留骨膜、切除与截骨等长的骨膜和在切除与截骨等长骨膜的基础上通过扩髓去除两断端骨内膜等，它们的修复能力依次降低，对应的临界缺损值也依次减小。

在对负载骨骨形态发生蛋白BMP-2、生长因子或成骨细胞的骨替代材料所进行的动物实验中，为避免植入后受周围组织所释放的生长因子、成骨细胞等自身修复因素的干扰，常用不可吸收膜采用包裹或隔离的方式［23，28］，阻止血管长入及阻碍营养物质和生长因子等进入骨修复区域，以客观反映载体的成骨性能及其与未负载或负载不同生物成分的骨替代材料在修复能力上的差异。

5 模型的固定方式

骨缺损实验的固定方式主要有髓内针、钢板［14，29，30］、外固定架［31］、自制固定器［32］等方式。髓内针固定需要移植材料中部有孔，多用于移植骨、医用金属等具有中空结构的力学性能较好材料的实验；钢板内固定很常见，如需加强固定可增加钢丝或手术缝线在骨与钢板或植入材料之间进行捆扎［14，29，30］，动物实验中因动物活动等在外固定固定的种类上只能采取单臂外固定器进行固定。

不需要固定的模型，其优点是不会受到异物排斥、影像阻挡、固定物费用限制等的影响。而需要固定的模型取螺钉会留孔洞，将影响生物力学的测试，但可以减少骨不愈合或畸形愈合等并发症。

6 新西兰兔一般信息的选择

6.1 年龄

兔子的平均寿命为8～12年［33］。新西兰兔年龄阶段［34］分为：仔兔：0～1个月；幼兔：1～3个月；中期兔（青春期）：3～8个月；成年兔：8个月～3岁；老年兔：3岁以上。

新西兰兔的年龄对CSD的大小有较大的影响。现阶段实验结束时间常设置在12周左右，选择骨修复能力快的中期兔和成年兔。幼兔的生长发育较快，但骨骼强度较弱不利于固定器的固定以及耐受手术的能力较差，常只作为骨髓间充质干细胞等生物成分的提供者。

实验一般选择骨成熟的兔，可参考兔龄和影像检查。4月龄新西兰兔骨骼已生长至其长骨长度的95%，且在5～8个月龄时停止［35］；有学者认为幼年兔的缺损较容易修复，建议实验选择大于6个月的兔［11，36］。同样的，宋子鉴等［37］认为 8 个月龄兔骨骼生长基本发育成熟，可选择8个月龄兔代表成年兔进行骨缺损模型的制备；Schlickewei等［20］为保证兔子骨骼成熟，只纳入6个月及6月以上的兔，并通过X线观察骨的发育情况来挑选需要的兔。此外，宋子鉴等［38］实验发现6个月龄或更大的兔，其扭转力学特性渐渐趋于平稳。

综上所述，可选择6个月或>6个月龄的兔作为骨缺损动物模型。如实验有需要，兔龄结合影像检查的方法同样适用选择出幼龄兔或老年兔进行相关年龄阶段的骨缺损修复实验。

6.2 性别

性别对CSD的影响暂不清楚。Mapara等［39］认为性别的选择通常没有标准，但研究人员倾向选择更加温顺的雌兔；而Mills等［40］认为雌性激素周期对骨的生长有显著影响，尤其是生殖泌乳期间，骨生长会受到极大的抑制。同时，6个月龄雌性兔子已达到性成熟［21］。因此，在实验中多数学者倾向选择雄性兔或>6 个月龄雄兔作为实验对象［12，19，21，25，37］。

6.3 体重

新西兰兔体重是实验需要考虑的影响因素，一般选择3～3.5 kg以上的健康新西兰兔进行实验，可使实验对象具有良好的承受外科手术的能力，并能防止大多数严重的术后问题，可获得更高的生存率［39］。有研究表明体重过大会使实验过程中桡骨干缺损模型的尺骨发生骨折［36，37］。

兔桡骨模型因不需要内外固定装置稳定断端，体质量较大直接导致日常活动中尺骨受力增大，在双侧同为实验部位时更容易发生骨折，从而在实验过程中需剔除或替换骨折兔。因此，为了实验的顺利进行，桡、尺骨模型选择体质量不宜过大；其他长骨模型因需固定，同种情况下体重带来的影响因素更小。

6.4 日常活动量

在兔骨缺损的相关研究中，较大的居住空间可以增加日常活动量，对骨骼的形成有促进作用［36］。对于居住空间大小的选择需根据实验目的、经费、饲养及护理条件的实际情况进行设计，较大的活动空间可能使兔子活动过多导致内固定物松脱甚至折断，需要考虑更多不确定的因素。而标准大小的笼饲养单只兔可避免疥疮等高度传染性疾病在兔群中传播，且不会出现互相撕咬、竞争食物等情形；如果不是实验明确需要，选择标准笼饲养兔是首选。

7 小结

新西兰兔骨缺损的长度是CSD模型的主要影响因素，年龄、骨膜剥离度和居住空间（日常活动度）对骨的生长也有影响，从而影响缺损的临界值；性别因素的影响暂不明确，体重过大可能影响固定的稳定性，甚至在双骨部位发生支撑骨的骨折；骨骼结构和部位可以限制骨缺损的大小和类别的选择。

另外，新西兰兔骨缺损动物模型的制作及设计需综合考虑:（1）根据实验经费、目的、骨缺损制备手术的难易度和不同模型的优缺点，选择合适的部位、缺损值；（2）合理调整缺损的次要影响因素，如年龄、体重、居住空间、骨膜剥离度等；（3）合理设置兔的数量，并通过影像学和组织学等检查方式，确认在实验结束后未移植材料的缺损不能自愈。综合近年来新西兰兔骨缺损模型的实验，为简便操作，可选择在标准笼中饲养6个月及6个月以上、体重3～3.5 kg的新西兰兔作为骨缺损动物模型，根据部位合理选择模型类别、骨膜剥离情况和缺损大小，最后再作适当的调整。