基因编辑治疗原发性免疫缺陷病

刘珊 方姝煜 综述 安云飞 审校

（重庆医科大学附属儿童医院风湿免疫科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿童感染免疫重庆市重点实验室，重庆 400014）

［中国当代儿科杂志，2021，23（7）：743-748］

一直以来，精准有效地编辑活细胞基因组DNA是生命科学和医药领域的主要目标。基因编辑技术提供了一种相对快速且简单的方法，实现了对目标基因的删除、替换和修改。随着锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）、规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）等特异性人工核酸酶的出现，该技术逐渐发展为一套较成熟的体系，使得基因相关疾病得以更有效地治疗和预防。原发性免疫缺 陷病（primary immunodeficiency disease，PID）是一类主要由单基因突变导致的免疫细胞发育或功能异常性疾病，免疫重建是根治的关键。基因编辑的出现为PID的治疗提供了新选择。本文将从基因编辑发展沿革入手，概述ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、碱基编辑和先导编辑，并简述基因编辑在PID中的应用。

1 基因编辑

基因编辑，一种通过删除、插入或替换基因组的某个片段或特定碱基使基因组发生特定变化的分子技术，目前广泛用于生物学研究中［1］。起初该技术通过产生DNA双链断裂（DNA doublestrand breaks，DSB）激活非同源末端连接及同源定向修复等细胞内源性修复机制发挥作用。前者在断裂位点随机引入插入缺失，后者则以供体DNA为模板诱导可预测的基因表达［2-3］。在修复过程中，两种途径同时发生并且相互竞争，但多数情况下以非同源末端连接为主，因此编辑过程中不可避免出现副产物。对于已知的致病性突变而言，纠正目标位点的突变才是治疗的最终目的。因此研究者后续开发出无需产生DSB的碱基编辑和先导编辑，掀起了基因编辑技术应用的新篇章。

1.1 ZFN

ZFN由锌指蛋白介导的DNA识别域和源自海床黄杆菌的核酸内切酶FokⅠ介导的DNA切割域组成。通常，锌指蛋白由ββα结构的锌指串联组成。其中，α螺旋能插入DNA双螺旋的大沟，特异性识别靶链的3个连续核苷酸。FokⅠ可非特异性切割DNA，但需二聚体的形成。当ZFN二聚体反向识别位点相距6～8 bp时，FokⅠ切割靶位点产生DSB，激活内源性修复［4］。锌指结合特性和效率受内部氨基酸和临近锌指结构的影响，这使ZFN的直接构建或筛选耗时耗力。此外，三联体识别模式限制了可靶向范围。并且基因组中存在多个与目标位点相似的序列，可成为额外的靶点导致脱靶编辑。但不可否认，ZFN作为开创性技术，为基因编辑在各领域的应用奠定了夯实的基础。

1.2 TALEN

TALEN由转录激活因子样效应物（transcription activator-like effector，TALE）介导的DNA结合域和FokⅠ介导的DNA切割域组成。TALE由重复单元串联构成。重复单元除重复可变双残基（第12、13位氨基酸）不同以外，其余高度相似。1个重复可变双残基能特异性识别1个碱基。与ZFN相似，TALEN也有组件FokⅠ，但需要10～30 bp的间隔才能实现切割［5］。与ZFN相比，TALEN技术的DNA识别域长、识别单元不受临近单元的影响、识别密码简单对应等特性，使得其识别序列更广、设计更灵活。但是由于广泛相同的重复序列导致TALE克隆困难，并且结合位点需以碱基T开始，这使得TALEN技术的应用受到限制。随着“Golden Gate”分子克隆、高通量固相组装和独立连接克隆技术的出现，可快速设计装配自定义TALE阵列，而无碱基识别限制的突变体克服了5'-T这一难题［6］。这使得TALEN技术成为基因编辑的有力工具。

1.3 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas系统是细菌、古菌的适应性免疫防御系统，通过RNA引导核酸切割来抵抗外来遗传物质对自身的影响。该系统由单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA）和Cas9核酸内切酶组成。其中，sgRNA与靶序列互补配对，而Cas9识别紧邻靶点的前间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM），并执行剪切功能［7］。其作用过程为：Cas9识别合适的PAM后DNA双螺旋解开，sgRNA识别目标序列形成RNA-DNA异源双链。此时R环形成，导致Cas9发生构象改变而激活剪切活性，对DNA进行切割产生DSB［8-9］。与前两种编辑方法相比，CRISPR/Cas9系统使用更精准的碱基互补配对识别方式，组件sgRNA的构建也更简单及节约成本。但CRISPR/Cas9系统存在PAM限制、脱靶切割及系统递送障碍等限制。通过改变Cas9同源序列对比、蛋白结构和蛋白定向进化等方法突破PAM限制，扩大了可靶向基因范围。同时突变体Cas9单切口酶（Cas9 nickase，nCas9）、双sgRNA组合及截短的sgRNA则降低了脱靶率［10-11］。而通过寻找到更小的Cas9蛋白［12］或者将Cas9分装为两个载体［13］等方法增加了递送可行性。这一系列策略大幅度提高了CRISPR/Cas9系统的应用价值。

1.4 碱基编辑

在人类已知的致病性突变中，单碱基突变高达58%，因此开发一种精准且高效纠正点突变的技术尤为重要［14］。碱基编辑由sgRNA、修饰的Cas9蛋白和脱氨酶组成，无需DSB、供体模板及同源定向修复，便能对点突变进行精准修复［15］。目前，碱基编辑可分为胞嘧啶碱基编辑系统（cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤碱基编辑系统（adenine base editor，ABE），前者将靶点胞嘧啶（cytosine，C）替换为胸腺嘧啶（thymine，T），后者则将靶点腺嘌呤（adenine，A）替换为鸟嘌呤（guanine，G）［16］。其作用过程为：在sgRNA和修饰的Cas9蛋白作用下形成R环后，脱氨酶直接作用于R环中未与sgRNA互补的无序单链，将其编辑窗中目标碱基（C/A）脱氨为中间产物（C→U、A→I），进而通过DNA复制或修复转变为目标产物（U→T、I→G）。

CBE最初仅由sgRNA、催化失活的Cas9（dead Cas9，dCas9）和大鼠胞嘧啶脱氨酶组成。为了提高编辑效率和降低副产物的生成，研究者加入破坏尿嘧啶碱基切除修复的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂及使用触发胞内碱基错配修复的nCas9［15］。此外，化脓性链球菌Cas9（Streptococcus pyogenesCas9，spCas9）同源物和突变体、自然及突变进化的胞嘧啶脱氨酶的使用也可扩大CBE编辑范围，同时增加精准度和效率。由于已知的腺嘌呤脱氨酶不能以DNA为底物对A进行脱氨，Gaudelli等［16］构建人工定向进化的腺嘌呤脱氨酶，与野生型腺嘌呤脱氨酶形成异二聚体，再与nCas9融合，这才开发出了ABE系统。ABE系统的改进也可以借鉴CBE系统优化策略，但ABE对除野生型spCas9外的Cas结构域兼容性比CBE低。在最近的研究中，Richter等［17］对腺嘌呤脱氨酶进行噬菌体辅助的非连续和连续进化解决了当前ABE对部分Cas蛋白的不兼容。在实际应用中，ABE系统编辑的副产物更少，其可能原因为胞内肌苷的切除比尿嘧啶的切除要慢很多。并且双细胞胚胎注射进行全基因组脱靶分析可对脱靶编辑进行评估后显示ABE脱靶率远低于CBE［18］。这一系列优势说明ABE系统更具临床应用价值。碱基编辑开创了碱基转换的先河，但不能实现碱基之间的颠换。而C→A/G的糖基化酶碱基编辑器［19］和靶序列双碱基编辑器［20］，让碱基编辑使用更宽广。

1.5 先导编辑

先导编辑是一种“搜索并替换”的多用途且精确的基因编辑技术，无需DSB或DNA模板便能介导靶向删除、插入和碱基间的替换［21］。先导编辑由向导RNA（prime editing extended guide RNA，pegRNA）及Cas9-逆转录融合蛋白复合体组成。与原始sgRNA不同，pegRNA的3'端有两个功能区，一个为引物结合位点可起始逆转录；另一个是逆转录模板可实现基因修饰［22］。Cas9蛋白为切割含PAM的DNA链的nCas9，其作用机制为：目标序列连接后，nCas9切割含PAM的DNA链，其靶链3'断裂端与pegRNA互补后，启动逆转录；随后未被修饰的5'断裂端被切除，经DNA连接酶连接断端便实现了精准编辑。Anzalone等［21］通过使用逆转录酶突变体及增加sgRNA剪切非编辑链触发细胞错配修复途径等方法将先导编辑系统进化至第3代。为了最佳编辑效率，关键组件pegRNA的组装除根据既往经验选择合适长度的引物结合位点和逆转录模板外，还需考虑其他因素［23］。

先导编辑原则上可纠正89%人类疾病相关的已知遗传变异，并且与CRISPR/Cas9系统相比，在同样的编辑位点先导编辑展现出更低的脱靶率。同时，先导编辑介导所有碱基间的替换，补充了碱基编辑的不足。但仍需要解决一些问题，比如：细胞状态和细胞类型对该系统编辑效率的影响，目标产物和副产物编辑的DNA修复机制需深入了解，并且体内应用先导编辑工具的递送策略需进一步开发［23］。

2 基因编辑在PID中的应用

PID是一类影响免疫系统发育和/或功能的异质性单基因遗传病，目前分为10类共430种［24］。PID可导致宿主免疫功能严重受损，增加了对危及生命的感染、自身免疫和恶性肿瘤的易感性，具有极高的病死率［25］。尽管同种异体造血干细胞移植可治愈PID，但受供体来源、患儿健康状态和致病基因种类等因素的影响，大多数患者无法接受该治疗。并且移植后患者也会面临患移植物抗宿主病及移植物排斥的风险。基因治疗将正常基因导入自体造血干细胞后再进行移植，一定程度上解决了传统造血干细胞移植面临的问题。但是半随机整合载体都存在插入性致癌风险。尽管改进病毒载体能降低该风险，但仍不能实现基因表达的生理性调控。而基因编辑原位纠正基因，使基因表达受内源性调控。目前，基因编辑技术在PID的治疗应用中常与自体造血干细胞移植相结合，提供了一种治愈可能的理想方案。

2.1 X-连锁重症联合免疫缺陷病

X-连锁重症联合免疫缺陷病（X-linked severe combined immunodeficiency disease，X-SCID）是SCID最常见的类型，由IL-2受体共同γ链（IL-2 receptor common gamma chain，IL2RG）缺陷导致细胞内信号转导障碍，造成T、B、NK细胞数量及功能缺陷。既往研究表明，IL2RG表达正常的淋巴祖细胞比缺陷祖细胞更具选择性生长优势，因此只需少量校正的造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）即可重建T细胞免疫［26］。2014年，Genovese等［27］首次运用ZFN将包含IL2RG基因外显子5～8互补DNA（complementary DNA，cDNA）导入X-SCID患者HSPC的致病基因中，后代细胞显示出正常的IL2RG表达。为突破HSPC的培养及扩展限制，2015年研究者使用XSCID患者来源的诱导多能干细胞进行实验，并利用设计更灵活的TALEN对目标基因座定点修饰，观察到前体T细胞及成熟NK细胞的产生［28］。为评估校正后的HSPC免疫重建的有效性和安全性，研究者使用ZFN将完整IL2RG的cDNA整合到原基因座的内含子1处，并将所编辑的HSPC移植入实验小鼠中，在第16周显示出同源定向修复校正的细胞平均为12%，超过免疫重建所需功能性HSPC的阈值［29］。而最近的一项研究中改用特异性更高的CRISPR-Cas9实现了高效整合，并无异常造血和脱靶突变的迹象，这为97%以上的X-SCID患者建立有长期治疗及潜在治愈策略的临床开发提供强有力的支持［30］。

2.2 慢性肉芽肿性疾病

慢性肉芽肿性疾病（chronic granulomatous disease，CGD）由负责中性粒细胞呼吸爆发的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶复合物亚基编码基因缺陷导致，临床上以反复严重感染、炎症性疾病及肉芽肿形成为特征。研究表明，XCGD患儿临床获益所需功能正常的中性粒细胞约为10%～15%，因此基因编辑的治疗作用易在CGD中体现［31］。在CGD致病基因中，CYBB基因占比65%，而NCF1基因占比25%，因此该病的治疗主要集中于这两类型［32］。2011年，Zou等［33］的研究中首次使用ZFN介导密码子优化的CYBB基因靶向插入X-CGD患者诱导多能干细胞的安全港基因座中，观察到CGD表型的完全功能校正。然而，诱导多能干细胞只能产生少量的造血干细胞，因此2017年研究者采用CRISPR/Cas9系统对X-CGD患者的CD34+HSPC进行校正，测序确认超过20%HSPC的基因修复，植入小鼠体内可产生功能正常的人骨髓/淋巴样细胞，并无插入缺失突变产生［31］。NCF1基因最常见的突变是外显子2核苷酸GT缺失（ΔGT），而该基因附近高度保守的假基因NCF1和NCF2也有该突变。2017年，有研究使用ZFN对CGD患者的诱导多能干细胞中NCF1基因外显子2ΔGT进行校正，显示在NCF1基因座或其假基因上的基因校正，引起与氧化酶活性恢复相关的p47蛋白的表达［34］。这是由基因编辑介导假基因修复的单基因疾病功能校正的首次报道。但由于3个编辑位点存在可导致更大的缺失、倒位和易位，从而潜在地导致染色体不稳定［35］。因此在随后Khan等［36］的研究中，选用与假基因有3个额外碱基对差别的NCF1内含子1作为靶点通过CRIS‐PR/Cas9介导小基因插入，观察到p47phox的表达几乎恢复到野生型水平。

2.3 其他原发性免疫缺陷病

X连锁高IgM综合征指活化T细胞表面CD40配体基因突变引起免疫球蛋白类别转换重组障碍的单基因疾病。2016年，Hubbard等［37］首次使用TALEN介导致病基因修复，实现了患者T细胞CD40配体的正常表达和IgG类别转换的修复。而Kuo等［38］的研究更注重于HSPC的基因编辑，将使用TALEN或CRISPR-Cas9校正的HSPC移植入免疫缺陷小鼠中能达到临床相关水平的编辑率，这为永久性治疗该疾病提供了基础。Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome，WAS）由WAS基因突变使WAS蛋白缺乏导致，临床以血小板减少伴血小板体积减小、湿疹、免疫缺陷、易患自身免疫性疾病和恶性肿瘤为特征。在Laskowski等［39］的研究中，首次利用ZFN将功能性基因导入诱导多功能干细胞的相应基因座中，观察到正常WAS蛋白的表达。而最新的研究则利用CRISPR-Cas9技术向WAS病人HSPC中递送编辑试剂，校正细胞多达60%，并且无细胞活力和分化潜能损害［40］。

3 挑战与展望

目前CRISPR/Cas系统及其衍生系统碱基编辑和先导编辑为各领域的研究热点。然而，在最近发现，人类血液中存在针对Cas9蛋白的抗体和T细胞［41］。虽然目前对已存在T细胞的杀伤能力尚不清楚，但使用具有Cas9蛋白组件的基因编辑工具治疗人类疾病时，其安全性需要着重考虑。针对这一问题，研究者们提出一些思路来解决，比如：使机体免疫抑制或缺失来防止细胞对Cas9的严重反应，或者使用不感染人体或正常寄生菌的Cas9蛋白，又或者在人类对Cas9产生适应性免疫反应之前使用基于Cas9的疗法，但这些方法的有效性有待验证。

对于PID的基因编辑，大多数研究仍处于临床前研究阶段，临床应用面临的最大挑战是从体外到体内同源定向修复率的不断变低。这可能是由于同源定向修复更易发生在S/G2期，因此分化程度越高的短期干细胞越易发生定向编辑，而更原始的长期干细胞则进行非同源末端连接。并且原始造血干细胞可能对双链断裂更敏感，在编辑过程中易于受损。这导致有长期再生能力的干细胞未进行真正的基因校正，或是校正后由于受损失去了移植和自我更新的能力。虽然有一些研究表明，使用一些小分子暂时控制DNA修复［42］和操纵DNA修复蛋白［43］，能维持和扩增真正的造血干细胞数量，但也只是增加了基因校正造血干细胞的数量。迄今为止，如何编辑真正长期移植、具有自我更新能力的干细胞仍是一大问题。

目前，DNA修复机制、干细胞生物学和基因组编辑技术方面的研究快速进展，基因编辑PID应用有极大希望发展到临床阶段。此外，它有望治愈无法通过增加基因拷贝策略治疗的疾病，也可以治愈因同种异体骨髓移植而病重的患者。尽管该领域仍然存在未解决的问题和许多挑战，但是基因编辑在PID根治中具有巨大的潜力毋庸置疑。