秀丽隐杆线虫对益生菌鉴定研究进展

闫锟儒， 吴亚云

贵州医科大学 感染性疾病科，贵州 贵阳 550025

人和动物肠道中具有非常复杂而平衡的微生物群，这些微生物通常可以起到如下作用：(1)营养[1]；(2)防御[2]；(3)免疫调节[3]；(4)促进生长、抗衰老及抑制肿瘤[4]。突然改变膳食、紧张或使用抗生素会扰乱这种微生物群平衡，使宿主易患病及降低对食物的利用效率。益生菌具有重建自然平衡和使宿主恢复正常健康和营养状况的能力。摄入益生菌以调节肠道菌群分布对于病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病[5]及酒精性肝病[6]等肝疾病所致肝纤维化有明确的治疗效果。笔者课题组也有研究表明，双歧杆菌、苗族腌汤通过上调肝组织中白介素-22水平、保护肠黏膜机械屏障，可之治疗硫代乙酰胺所致急性肝衰竭[7-8]。秀丽隐杆线虫具有较简单的肠道结构，其细胞内部基因调控相关研究已经较为深入，其与哺乳动物间存在高度的保守性，也符合无特定病原体动物以及无菌动物的标准，可视为良好的动物模型[9]。本文对目前秀丽隐杆线虫对益生菌鉴定的优势及研究进展作以综述。

1 益生菌与肝纤维化

肝纤维化作为病理生理过程，主要是由外界的各种致病因子导致肝内的结缔组织出现增生异常，其按照病因可分为病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病[10]、酒精性肝病及自身免疫性肝病等。益生菌，也被称为“新的虚拟代谢器官”，与许多睾丸外器官形成轴样关系。肠-肝轴[11]是胃肠道和肝之间紧密的解剖和功能双向相互作用的结果，主要通过门静脉循环。肝与肠道菌群间的共生关系是由一个复杂的网络进行调节和稳定的，该网络包括免疫、代谢和神经内分泌间的相互作用[12]。肠上皮内紧密连接是细菌及其代谢产物的天然屏障[13]。来自病原微生物的抗原可以通过这些连接激活人体的适应性免疫系统。与病原体密切相关的小分子物质(PAMPs)，可以利用NOD样受体及TOLL样受体来激活核转录因子κB，进而分泌大量趋化因子和炎性因子进入门静脉循环。除肝细胞损伤外，PAMPs还能够激活并参与调控纤维化的星形细胞，而Kupffer细胞对脂肪酶产生的反应强过肝细胞[14]。故肠-肝轴对肝疾病影响及发病机制是目前临床研究的热点之一。

2 秀丽隐杆线虫应用于益生菌的研究

2.1 秀丽隐杆线虫应用于乳杆菌的研究 Schifano等[15]发现，从食源性微生物群中分离的发酵乳杆菌MBC2对秀丽隐杆线虫的寿命、能量代谢和抗氧化应激有明显的正向影响，参与其中的分子依赖于寡肽转运体1和转录因子DAF-16，这表明其可能参与了宿主与微生物的相互作用。Sharma等[16]基于存活率的Kaplan Meier法表明，益生菌培养通过线虫肠道的粘附和进一步定植延长了线虫的寿命，该研究的观察结果提示，益生菌培养可以延长蠕虫的寿命，而不丧失任何生理功能。de Barros等[17]分析了25株从临床患者体内分离的乳酸菌，在体外降低白色念珠菌丝(Candida albicansATCC 18804)形成的能力，被感染的秀丽隐杆线虫的存活率提高了29%。加氏乳杆菌SBT2055是一种乳酸菌益生菌。Kobatake等[18]证明了加氏乳杆菌SBT2055饲育延长了秀丽隐杆线虫的寿命，其延长寿命的作用依赖于氧化应激反应的调节。加氏乳杆菌SBT2055处理抑制了百草枯处理细胞的这些反应，说明加氏乳杆菌SBT2055对哺乳动物细胞的氧化应激具有保护作用。细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)已成为宿主与病原体相互作用的潜在重要介质。Li等[19]利用秀丽隐杆线虫和人类细胞，研究了植物乳杆菌产生的EVs在调节宿主对万古霉素耐药粪肠球菌反应中的作用，结果显示，植物乳杆菌WCFS1产生的EVs可上调宿主防御基因的表达，并对宿主提供保护作用。Azat等[20]从新疆传统发酵干酪中分离得到6株乳酸菌，对其功能特性、益生菌特性及作为发酵剂的潜力进行了评价，6株菌株均耐酸性和胆盐条件，其中，鼠李糖乳杆菌R4表现出较好的抗菌、自动聚集、疏水、降脂及自由基清除活性。为了进一步研究这些实验室菌株对宿主寿命的促进作用，该研究使用秀丽隐杆线虫作为体内模型，与喂食大肠杆菌OP50的线虫相比，喂食鼠李糖乳杆菌R4作为食物来源的线虫的寿命显著延长。

2.2 秀丽隐杆线虫应用于双歧杆菌的研究 Sugawara等[21]阐明了灭活双歧杆菌对秀丽隐杆线虫的几种生理作用，包括增强抗应激能力、提高运动能力和延长寿命。DAF-16和SIR-2.1分别介导热应激耐受和寿命，灭活双歧杆菌剂量依赖于激活DAF-16，DAF-16核易位延长秀丽隐杆线虫的寿命，其通过SIR-2.1激活DAF-16诱导延长寿命。DAF-16结合HSF-1诱导hsp-12.6基因的表达，HSF-1可以被激活，并与DAF-16在细胞核中进行翻译。因此，灭活双歧杆菌的生理作用依赖于DAF-16。Zhao等[22]利用秀丽隐杆线虫模型，阐明了不同的信号通路，特别是DAF-16通路对延长寿命的作用，结果发现，长双歧杆菌菌株BB68通过激活TIR-1-JNK-1-DAF-16信号通路，延长线虫的寿命，且该菌株的细胞壁成分有助于延长线虫的寿命。Martorell等[23]研究发现，通过益生菌补充剂调节微生物群对支持肥胖治疗具有重要意义，该研究探讨了双歧杆菌的功能作用及其代谢靶点，动物双歧杆菌亚种乳酸乳球菌CECT 8145筛选自秀丽隐杆线虫，该菌株可显著降低总脂肪和甘油三酯水平，对线虫具有抗氧化作用。

2.3 秀丽隐杆线虫应用于革兰氏阳性球菌的研究 Chelliah等[24]通过研究韩国传统发酵食品中分离的乳酸菌的体内外益生菌特性，发现特定的乳酸片球菌(P.acidilactici DM-9)、短属片球菌(L.brevis SDL1411)、戊糖片球菌(P.pentosaceus SDL1409)在模拟肠液中表现出耐酸(66%～91%)、抗胃蛋白酶(64%～67%)和存活能力(67%～73%)，该研究表明秀丽隐杆线虫可能是筛选有效益生菌的一个易于处理的模型。埃氏巨型球菌寄生在人的肠道内，具有益生菌的潜力。Kwon等[25]研究发现，与标准食物大肠杆菌OP50相比，埃氏巨型球菌显著延长了秀丽隐杆线虫的寿命，可以延缓衰老，并增强了秀丽隐杆线虫对人类病原体伤寒沙门氏菌的抵抗力。Neuhaus等[26]研究发现，与无毒细菌相比，肠出血性大肠杆菌O157:H7可缩短秀丽隐杆线虫的寿命，将肠出血性大肠杆菌O157:H7与粪肠球菌共同喂养可显著延长线虫的寿命，在粪肠球菌存在下，几种病毒相关基因，包括毒力关键基因(如毒力岛、鞭毛、群体感应系统)下调，进而考虑粪肠球菌在线虫模型中是一种保护性益生菌。

2.4 秀丽隐杆线虫应用于其他益生菌的研究 Kato等[27]研究证明，丁酸梭菌MIYAIRI 588(clostridium butyricum MIYAIRI 588，CBM 588)可延长秀丽隐杆线虫的寿命，所涉及的机制依赖于DAF-16/FOXO和SKN-1/Nrf2转录因子，DAF-16依赖Ⅱ类基因受CBM 588调控，CBM 588可能通过调节DAF-16途径发挥其延长寿命的作用。因此，调控益生菌CBM 588作用的DAF-16依赖机制值得研究。Sharma等[28]报道了益生菌对秀丽隐杆线虫模型系统中大肠杆菌的抗菌活性和竞争性排斥能力，利用益生菌对寄主进行预处理是预防病原菌感染、侵袭和进一步定植的最佳策略。Olgun等[29]发现，二甲双胍可以通过降低细菌的叶酸和蛋氨酸产量来延长秀丽隐杆线虫的寿命，但这可能会扰乱肠道微生物群的平衡，从而导致胃肠道不良反应。故全球数百万2型糖尿病患者可以通过补充叶酸来治疗二甲双胍引起的胃肠道不良反应，即腹泻。Han等[30]通过对3983种大肠杆菌活性物质的筛选，发现29种细菌基因被删除后，能够延长宿主秀丽隐杆线虫的寿命，这些细菌突变体中的一部分还能保护宿主免受与年龄进展相关的肿瘤生长和淀粉样蛋白积累；该研究还发现了5种细菌突变体通过增加分泌荚膜异多糖酸酸来延长寿命，其可调节宿主的线粒体动力及未折叠蛋白反应。Donato等[31]利用芽孢形成的枯草杆菌和秀丽隐杆线虫模型，探讨益生菌对寄主寿命的影响机制，该研究发现，富含生物膜的枯草杆菌在秀丽隐杆线虫的肠道中定植，延长蠕虫的寿命明显长于缺乏生物膜的同基因菌株。枯草杆菌的长寿效应主要是由于胰岛素样信号系统的下调，而胰岛素样信号系统正是人类百岁老人健康长寿的关键。这些发现提示，在食品和饮料中经常食用枯草杆菌或许能显著延长人类的预期寿命，并有助于阻止与年龄有关的疾病的进展。Hwang等[32]开发的工程益生菌(大肠杆菌1917)在两种动物模型体内对铜绿假单胞菌的肠道感染具有预防和治疗作用，这些发现支持工程微生物的进一步发展，具有潜在的预防和治疗肠道感染的活性。

3 展望

秀丽隐杆线虫作为益生菌研究的重要模型，主要是由于其具有模式生物的诸多优势：(1)线虫的世代周期较短，仅3 d左右，且线虫的整体寿命接近3周，实验操作的周期很短。(2)容易培养和操作。线虫的个体较小，食物为大肠杆菌OP50，非常容易得到。线虫的冻存及活化操作简便，且具有极强的繁殖力，卵数量多，成活率高，容易得到同期化的线虫，极大降低了实验误差。并且，线虫具有独特的自体受精手段，无需考虑其亲缘关系对实验产生的影响，提髙了实验结果的准确性。(3)线虫的身体透明，脂肪颗粒标记简单，大多存在于肠道和皮下组织，容易选择染色试剂，染色后采用显微镜即可观察到线虫体内脂肪是否发生聚集[33]。(4)线虫作为多细胞真核生物，具有与高等动物类似的细胞结构。(5)线虫己经完成了全基因组测序，具有清楚的遗传背景。60%～80%的线虫基因和人类基因是高度保守的，多条信号途径也与人类类似。(6)线虫体内的脂肪酸合成、代谢通路与人类具有高度的相似性，83%蛋白质组序列与人类具有同源性[34-35]。

目前，本课题组拟进一步研究苗族腌汤所包含的益生菌，对于病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及酒精性肝病等肝疾病所致肝纤维化的治疗作用。秀丽隐杆线虫为该研究提供了一种简易的动物模型，同时也为其他益生菌(如双歧杆菌、芽孢杆菌等)和病原菌的研究提供了新的实验模型。