RNA-seq技术及其在糖尿病视网膜病变中的应用

聂泽彤 综述 胡博杰 审校

天津医科大学眼科医院 天津医科大学眼科研究所 天津医科大学眼视光学院 300384

自发现转录组是基因组和蛋白质组间的关键中间体以来，转录本的鉴定和基因表达的量化一直是分子生物学研究的核心内容[1]。20世纪90年代初，表达序列标签和基因表达序列分析是早期分析基因表达的方法，90年代末，微阵列由于其高通量的特性迅速成为研究基因表达的首选方法[2-4]。RNA-seq是一种使用深度测序技术的转录组学分析方法，可准确地捕捉数千个基因和RNA分子亚型，目前已成为转录组基因表达定量的金标准[5-7]。其利用高通量下一代测序技术来调查、表征和量化转录组，并且允许识别新的外显子、剪接位点和转录本[8-10]。RNA-seq现已广泛应用于神经系统、心血管系统、血液系统、消化系统等研究领域，并逐渐取代DNA微阵列，成为转录组分析的首选方法[11]。在眼科研究领域中，RNA-seq日渐成为一种重要的测序工具，在多种眼科疾病的研究中都取得了一定进展，为进一步明确诊断、发掘潜在致病基因、探索致病机制和临床方法提供新的思路[12-16]。本文从RNA-seq技术的优势、测序平台的选择、文库制备和数据分析以及该技术在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)中取得的进展进行综述。

1 RNA-seq技术的优势

RNA-seq技术与微阵列相比有明显的优势。第一，RNA-seq可用于检测已知的转录本，也可以识别、表征和量化新的剪接亚型，检测等位基因的特异性表达[11]；而微阵列仅可以对带注释的转录组进行全面采样，不能对整个转录组进行测序、发现新的基因和研究可变剪切转录本[8,17]。第二，它可以使研究人员对基因组进行正确注释，并在单核苷酸分辨率下定义基因的转录边界和表达单核苷酸多态性[18]。第三，相对于微阵列而言，RNA-seq的“背景信号”低，没有量化上限，可以更加准确测定RNA的表达水平，因此可以在更大动态范围内检测到转录表达水平的变化情况[19]。第四，RNA-seq可以与不同类型的生化分析相结合，分析RNA生物学的许多其他方面，如RNA蛋白结合、RNA结构和RNA相互作用，或者结合其他组学数据，将基因表达与基因组特征(如表观遗传变化、DNA序列改变和蛋白质相互作用)联系起来[6]。

2 RNA-seq测序平台的选择

在使用RNA-seq技术之前，首先要根据试验样本选择一个合适的测序平台，虽然大多数测序平台都遵循相似的处理步骤，但是在处理生物化学和产生阵列的方式上存在差异，因此获得的数据也大不相同[20]。当RNA样本数量有限时，首选Helicos测序，用于Helicos测序的样品制备步骤相对简单，同时省略了聚合酶链式反应扩增步骤。然而Helicos测序有1个固有的错误率，所以当要求测序错误率(<1%)时，则首选Illumina或SOLiD，二者相对于其他的测序方式在测序深度和测序能力上有极大的优势。当采用1种测序方法无法获取满意结果时，可以联合使用多种RNA测序方法，例如首先通过Illumina或SOLiD获得足够深度的短序列，其次使用Roche 454获得长序列，从而获取满意结果[21-22]。

3 RNA-seq文库制备和数据分析

在应用RNA-seq技术制备文库前需要采用化学水解或酶消化方法将RNA或互补DNA(complementary DNA，cDNA)片段化，以达到适合测序的尺寸，但是部分小RNA如微小RNA(microRNA，miRNA)不需要片段化处理。随后通过使用随机引物的逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后将适配器寡核苷酸连接到cDNA进行扩增和测序。测序完成后，用软件来分析测定的序列。测序数据分析主要分为2个阶段：首先，必须从数据集中删除测序工件和错误数据；其次，使用合适的定位器将处理后的数据对准参考基因组，并进行下游数据分析[20]。目前可做的分析有信号通路网络构建(Pathway)、加权基因共表达网络构建(WGCNA)、时间序列分析(Time Course)、功能层次网络构建(GO Network)、基因表达趋势分析(STC)、差异基因统计分析(聚类分析、GO富集分析、KEGG富集分析)及其他常规分析。

4 RNA-seq在DR中的应用

DR是糖尿病常见的微血管并发症，据估计，DR在成人糖尿病人群中的患病率为34.6%，是工作年龄人群致盲的主要原因[23]。近年来越来越多的研究表明，miRNA、环状RNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等非编码RNA可作为DR早期诊断和预测预后的潜在生物标志物，在DR发病机制和进展中发挥重要作用[24]。RNA-seq技术可以准确检测在DR发病机制中发挥重要作用的mRNA和非编码RNA，为扩大DR研究范围以及确定潜在治疗靶点提供基础。

RNA-seq技术通过检测血清生物标志物有助于早期检测DR，有望实现DR的早发现、早诊断、早治疗。一项研究应用RNA-seq分析2型糖尿病伴DR、2型糖尿病无DR患者和健康对照组人群的血清miRNA表达差异。发现由hsa-let-7a-5p、hsa-miR-new-chr5_15976和hsa-miR-28-3p组成的一组miRNA对2型糖尿病患者有无DR的鉴别有非常高的敏感性和特异性；深入研究发现hsa-let-7a-5p的过度表达可显著促进人视网膜微血管内皮细胞的增生，从而参与DR的发病过程[25]。另一项研究通过对轻度非增生性DR和增生性DR患者的血清进行RNA-seq分析，发现了6个显著差异表达的基因(CCDC144NL、DYX1C1、KCNH3、LOC100506476、LOC285847和ZNF80)，并交叉验证此类基因表达可以作为早期检测糖尿病患者增生性DR的潜在生物标志物[26]。

RNA-seq技术有助于准确认识DR动物模型病理过程中的基因调控。视网膜的发育依赖于复杂而精确的转录作用和转录调控，糖尿病会引起多种视网膜转录组发生变化[27]。Liu等[28]通过对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠视网膜进行RNA-seq分析发现，与正常对照组大鼠相比，糖尿病模型组视网膜中共鉴定出868个差异表达基因，其中上调基因565个，下调基因303个。在差异表达基因中，检测到94个凋亡基因和凋亡调节基因，19个炎症基因，KEGG通路显著富集分析结果显示细胞黏附分子富集，补体和凝血级联富集，抗原处理和表达富集。Fan等[29]通过对患有2型糖尿病的食蟹猕猴的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞进行RNA-seq分析发现，与非糖尿病组相比糖尿病组RPE细胞中共有2 744个差异表达基因，其中上调基因1 694个，下调基因1 050个，这些差异表达基因主要与补体激活，AGE/RAGE激活和炎症反应有关。

RNA-seq技术有助于寻找DR潜在治疗靶点。Dong等[30]通过对高糖诱导的猴视网膜血管内皮细胞进行RNA-seq分析发现，与正常对照组相比高糖组有449个差异表达基因，其中上调基因297个，下调基因152个，进一步研究发现其中BMP4基因表达可能是DR抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和抗纤维化治疗的潜在靶点。Niu等[31]分别对高糖联合抗VEGF、高糖联合抗VEGF及结缔组织生长因子双靶点干预作用下的2个组猴视网膜血管内皮细胞进行RNA-seq分析，发现卵泡抑素样蛋白1可能参与了DR的发病过程，是DR潜在的基因治疗靶点。

RNA-seq技术可精确揭示不同因素对DR模型干预后分子特征的变化，有助于探索其分子作用机制。吴绵绵等[32]通过RNA-seq探索α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)对高糖高脂刺激下视网膜血管内皮细胞中mRNA及lncRNA表达的影响，发现α-MSH可能通过上调lncRNA的表达来下调下游基因的mRNA表达。Savage等[33]应用RNA-seq技术检测过氧化物酶体增生物激活受体β/δ(PPARβ/δ)的拮抗剂和反向激动剂GSK0660在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)诱导视网膜内皮细胞的炎症中的作用，发现GSK0660可阻断TNF-α对白细胞募集相关细胞因子CCL8、CCL17和CXCL10表达的影响，从而干预TNF-α诱导的视网膜白细胞停滞，影响细胞增生、创伤反应、细胞识别和钙离子依赖性的胞吐作用。

DR是一种多因素的视网膜进展性疾病，其发病机制复杂，涉及多种不同的细胞、分子和通路。RNA-seq有可能提供关于DR的发病机制、未知通路和网络有价值且详细的信息，有助于更全面地探索DR的基因调控及分子机制，为DR的早期诊断、预防和寻找新的治疗靶点提供帮助。虽然RNA-seq已经成为各研究领域普遍使用的一项工具，但是其仍然面临许多挑战，例如大分子RNA的分割以及对庞大数据集进行分析[7-8,34]。此外，RNA-seq不能对单个细胞的基因组和转录组进行测序，无法识别样本中不同细胞之间的异质性[35]。然而随着越来越多的深入研究的进行，RNA-seq技术会更加优化，其未来的发展将为临床医生诊断和治疗眼科疾病提供更强有力的帮助。

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