视网膜色素上皮细胞移植研究进展及存在的问题

李腾 综述 陈晓冬 审校

西安市第一医院眼科 陕西省眼科研究所 陕西省眼科学重点实验室 陕西省眼科疾病临床医学研究中心 西北大学附属第一医院 西北大学 710002

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞位于视网膜和脉络膜间，具有重要的生理功能。RPE细胞受损会引起视网膜感光细胞异常和视网膜组织退化，导致一系列的致盲疾病如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和视网膜色素变性等。自1991年始，就有研究人员对RPE细胞移植进行研究，以期治疗与RPE细胞损伤相关的疾病[1]。目前根据移植细胞的来源可分为自体RPE细胞、自体虹膜色素上皮(iris pigment epithelium，IPE)细胞、异体胎儿视网膜色素上皮(fetal retinal pigment epithelium，fRPE)细胞、异体成人视网膜色素上皮(adult retinal pigment epithelium，ARPE)细胞、胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮(human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium，hESC-RPE)细胞、诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮(induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium，iPSC-RPE)细胞、以及基因修饰的RPE细胞。移植方法主要分为细胞悬液移植和细胞片移植。本文对RPE细胞移植的细胞来源、移植方法、存在的问题进行综述。

1 移植RPE细胞来源分类

1.1 自体细胞移植

1.1.1自体RPE细胞移植 自体RPE细胞移植可避免出现免疫排斥反应，是进行RPE细胞移植的首选。Zhang等[2]对兔子自体RPE细胞和脉络膜移植研究发现，自体RPE细胞和脉络膜移植物不仅具备支持感光细胞存活的能力，而且还能启动早期损伤修复机制。Veckeneer等[3]对18例湿性年龄相关性黄斑变性(wet age-related macular degeneration，wAMD)患者进行自体RPE-脉络膜片移植治疗并进行11个月随访，结果显示15例视力恢复，1例视力稳定，2例视力丧失，患者平均视力提高30个字母，2例患者在随访期间出现复发性新生血管膜。Boral等[4]对8例wAMD患者进行自体RPE-脉络膜片移植，平均随访(20±16.57)个月，患者最佳矫正视力由术前的(2.64±0.3)LogMAR提高为术后的(1.095±0.27)LogMAR，随访期间未出现不良反应。Parolini等[5]对84例wAMD和干性年龄相关性黄斑变性(dry age-related macular degeneration，dAMD)患者行自体RPE细胞-脉络膜移植并随访10年发现，平均最佳矫正视力由术前的20/320提高至术后的20/200，其中40%患者的视力提高了至少15个字母，术后出现视网膜脱离、黄斑萎缩、视网膜下出血、视网膜前膜、复发性脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)、黄斑裂孔、囊样水肿等并发症。自体RPE细胞几乎不会产生免疫排斥反应，但需进行手术取材，可能会对患者正常组织造成伤害，并且存在难以避免的术后并发症，因此自体RPE细胞移植的研究逐年减少。

1.1.2自体IPE细胞移植 IPE细胞与RPE细胞有相同的特征：(1)相同的胚胎(神经外胚层)起源；(2)胞质内均有黑色素颗粒；(3)形成紧密连接以维持生理屏障功能[6]。因此，有研究人员尝试用自体IPE细胞替代RPE细胞进行移植。Aisenbrey等[7]对20例CNV患者进行了IPE细胞移植研究发现，1例患者视力提高3行，13例患者视力保持稳定并且变化小于3行，3例患者视力降低3行，在36至48个月的随访期间未发现黄斑水肿和免疫排斥反应，术后血管造影均未有CNV复发的迹象。Abe等[8]对56例AMD患者进行了自体IPE细胞移植研究，术后随访2～8年发现，23例患者视力改善，27例患者视力保持稳定，6例患者视力降低；移植术后2周，1例患者视觉敏感度下降，并且出现短暂性轻度血管炎。Bennis等[9]对RPE细胞和IPE细胞的基因表达谱进行分析，结果显示视觉循环、跨上皮细胞运输、色素沉着等相关基因在2种细胞中有差异性表达。由于IPE细胞和RPE细胞本质上的差异，导致IPE细胞替代RPE细胞进行移植研究可能存在一些缺陷，所以自体IPE细胞移植的治疗方式近年来也鲜有报道。

1.2 同种异体细胞移植

1.2.1异体fRPE细胞移植 有研究显示小胶质细胞与视网膜早期发育有关，提示胎儿视网膜免疫原性低可能与视网膜的发育程度有关，这为fRPE细胞移植提供了可能[10]。Pan等[11]对视网膜退行性疾病小鼠模型进行fRPE细胞和间充质干细胞共移植研究，结果显示小鼠视功能有显著的恢复，并可抑制免疫排斥反应。Algvere等[12-13]在未使用免疫抑制剂的情况下对5例wAMD患者和4例dAMD患者分别进行fRPE细胞片移植和fRPE细胞悬液移植并随访8～20个月，结果显示在wAMD患者中fRPE细胞片移植造成患者视力逐渐下降，并在移植部位出现黄斑水肿及1～6个月的免疫排斥反应，在dAMD患者中，fRPE细胞悬液移植没有出现排斥反应，患者视力保持稳定。Weisz等[14]对1例65岁女性dAMD患者行fRPE细胞移植，发现在患者未服用全身免疫抑制剂的情况下，术后5个月视力趋于稳定，但光感受器相关蛋白出现弱免疫应答，提示在未使用免疫抑制剂的情况下，同种异体RPE细胞移植并非总是被排斥，且血-视网膜屏障可能有助于减弱免疫排斥反应。这些研究显示fRPE细胞的免疫原性低，是理想的细胞来源，但取材受限也影响了其大规模的临床应用。

1.2.2异体ARPE细胞移植 Tezel等[15]对12例wAMD患者行视网膜中心凹下切除手术并移植同种异体ARPE细胞，发现患者最佳矫正视力和视觉敏感度在随访的1年内没有显著变化，移植后的患者继续使用免疫抑制剂6个月后没有出现免疫排斥反应，术后并发症包括白内障、视网膜脱离、视网膜裂孔、黄斑皱褶，没有出现黄斑水肿。Algvere等[16]对11例dAMD和5例wAMD患者进行同种异体ARPE细胞移植研究，发现在未给予免疫抑制剂的情况下，11例dAMD患者中有5例在6～20个月内出现了排斥反应，所有wAMD患者均在随访的3个月内出现移植物排斥反应提示视网膜下同种异体ARPE细胞移植在没有应用免疫抑制剂的情况下呈现高免疫排斥率(75%)，然而由于wAMD破坏了血-视网膜屏障，可能增强移植物排斥反应，因此免疫排斥反应在wAMD患者中更早发生，这种现象出现的原因有待进一步探索。异体ARPE细胞的来源可能相对充足，但其移植后会引起较高的免疫排斥反应。

1.2.3hESC-RPE细胞移植 Araki等[17]研究发现胚胎干细胞和多能干细胞具有低免疫原性，从而降低免疫排斥反应。还有研究显示人胚胎干细胞表达低水平的白细胞抗原Ⅰ类分子，并且不表达白细胞抗原Ⅱ类分子[18]。Idelson等[19]研究发现hESC-RPE细胞具有免疫抑制能力，将hESC-RPE细胞与人外周血单核细胞共培养可抑制促炎性因子的分泌并诱导T细胞的凋亡。Ben等[20]对视网膜变性大鼠行hESC-RPE细胞移植，发现在使用免疫抑制剂的前提下，视网膜变性大鼠的视觉敏锐度和感光细胞的存活率提高。Liu等[21]对3例wAMD患者进行hESC-RPE细胞移植，随访第12个月时，视觉电生理检查显示3例患者视觉功能都有不同程度的改善，并且未出现任何不良反应。Schwartz等[22]分别对1例dAMD和1例Stargardt病患者进行hESC-RPE细胞移植研究，术后4个月未出现免疫排斥反应，dAMD患者视力增加了7个字母，Stargardt病患者视力增加了5个字母。Schwartz等[23]对9例dAMD患者9眼和8例Stargardt病患者8眼进行hESC-RPE细胞移植，发现在术前1周开始使用免疫抑制剂并持续使用6周的情况下,dAMD患者在随访第6个月时，4眼视力至少增加了15个字母，2眼增加了11～14个字母，3眼视力保持稳定，在随访第12个月时，3眼视力增加至少15个字母，1眼视力增加13个字母，3眼视力稳定；Stargardt病患者在随访6个月时，3眼视力至少增加了15个字母，4眼视力保持稳定，1眼视力减少11个字母，在随访12个月时，3眼视力至少增加了15个字母，3眼视力稳定，1眼视力减少超过10个字母，均未出现免疫排斥反应。hESC-RPE细胞移植后患者视力恢复显著、免疫反应性低、细胞来源充足，是目前临床上研究较多的移植方式，但其存在基因不稳定的风险，其疗效及生物安全性仍需进一步深入探讨。

1.2.4iPSC-RPE细胞移植 Kamao等[24]研究发现12种iPSC-RPE细胞中的154个基因与RPE细胞有相似的表达模式，只有2～4个基因处于低表达水平，iPSC-RPE细胞具有RPE细胞的免疫原性并表现出类似于RPE细胞的吞噬活性。Sharma等[25]研发出了人iPSC-RPE细胞贴片，在使用免疫抑制剂的情况下，对鼠和猪视网膜损伤模型进行了测试，结果显示iPSC-RPE细胞至少存活了10周并可缓解视网膜损伤。Sugita等[26]研究发现iPSC-RPE细胞可以抑制T细胞活化，将iPSC-RPE细胞移植到眼内可能是视网膜疾病的潜在治疗方法。Mandai等[27]对1例77岁女性息肉状脉胳膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)患者行自体iPSC-RPE细胞的移植治疗，发现在1年随访期间未出现免疫排斥反应和并发症，最佳矫正视力稳定。iPSC-RPE细胞的来源相对充裕，会引起较低的免疫反应，是可供移植研究的理想材料，但目前其临床应用较少，未来需对其进行进一步临床试验研究。

2 RPE细胞移植手术方法

细胞来源问题是RPE细胞移植当前一个重要的研究热点，同时成功将不同来源的供体细胞移植到黄斑区视网膜下，使其发挥理想的解剖和生理功能也是一个巨大的挑战。不同来源RPE细胞的取材方法有所不同，这也导致了RPE细胞移植手术方法有很大的差异。目前RPE细胞的移植方法主要有RPE细胞悬液移植和RPE细胞片移植，但是这2种移植方法的操作过程、移植后的免疫排斥反应程度和术后患者视力的恢复情况也有所差异。

2.1 RPE细胞悬液移植手术方法

RPE细胞悬液移植手术主要是将不同来源的RPE细胞制作成细胞悬液，将细胞悬液注射到黄斑区视网膜下间隙。van Meurs等[28]对8例CNV患者进行自体RPE细胞悬液移植，将RPE细胞从脉络膜上轻轻刮除，经导管吸出细胞，离心制备细胞悬液，将视网膜切开取出病变的脉络膜，向黄斑区中心凹下注射RPE细胞悬液，随访3～16个月发现，仅1例患者出现色素沉着，5例患者的视力保持不变，3例患者视力下降均伴有视网膜脱离，其可能是由于增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)引起的视网膜脱离。Binder等[29]对13眼原发性CNV和1眼激光治疗后引起的CNV进行自体RPE细胞悬液移植，在完成玻璃体切割手术后行视网膜切开取出黄斑下病变膜组织，在视盘鼻侧再次做视网膜切开，向视网膜下注射林格溶液，形成视网膜浅脱离，使用器械轻轻刮下RPE细胞，使用微量吸管吸出细胞悬液，然后将RPE细胞悬液注射到黄斑区视网膜下间隙，术后随访17个月时，8眼的最佳矫正视力提高2行以上，5眼最佳矫正视力保持不变，1眼最佳矫正视力减少超过2行，在术后观察期间未见CNV复发。这些研究表明RPE细胞悬液移植能通过较小的视网膜切口将供体细胞注射到病变位置，具有较小的手术创伤，可能对于手术的预后有一定的意义，但是供体细胞在视网膜下间隙的组织重构和功能重建情况仍然需要深入研究和长期观察。

2.2 RPE细胞片移植手术方法

Treumer等[30]对9例wAMD患者和1例dAMD患者进行自体RPE-脉络膜片移植，所有患者接受玻璃体切割和黄斑区新生血管切除术，然后在黄斑上方中周部视网膜行环形激光光凝，在环形激光斑内使用微套管实现局限性视网膜脱离，并切开视网膜，制作RPE-脉络膜植片，通过黄斑区视网膜切口，将植片尽可能放置在黄斑区视网膜下方，随访6～12个月发现，7例患者术后视力提高，1例患者视力保持稳定，2例患者视力下降，术后出现视网膜脱离1例，视网膜前膜2例。van Zeeburg等[31]对1例72岁wAMD患者行自体RPE-脉络膜片移植发现，移植后视力提高至20/32，并维持至术后13.5年。Lu等[32]对31例wAMD患者进行自体RPE细胞片移植，首先切除黄斑下病变组织，暴露新生血管周围的RPE细胞层，注入平衡盐溶液扩大范围，用显微剪刀分离单层RPE细胞植片，将游离RPE细胞植片植入黄斑区视网膜下，行激光光凝，最后向眼内填充硅油，结果显示术后患者视力改善(至少提高2行)的百分比为62.50%；对32例患者进行了RPE-Bruch膜复合物移植，发现术后患者视力改善的百分比为58.00%，2种移植方法均出现视网膜脱离、PVR和CNV复发等并发症。这些结果提示RPE细胞片移植的并发症较多，可能与手术创伤和过度修复有关，因此在未来的研究中需要进一步优化手术方案，减少术后并发症的发生。

3 问题与展望

不同细胞来源的RPE细胞移植方法各有其优缺点(表1)，自体RPE细胞和IPE细胞可避免发生免疫排斥反应，但这两者都是从患者眼内取材，容易因机械性剥离引起CNV和视网膜出血等并发症，因此自体移植方法仍然有待进一步深入研究。同种异体的fRPE细胞免疫原性低，细胞活力和分裂能力强，可产生大量用于移植的供体RPE细胞，是理想的移植细胞来源。同种异体的ARPE细胞易引起免疫排斥反应，所以此类临床试验日趋减少。hESC-RPE细胞和iPSC-RPE细胞都是由干细胞分化的RPE细胞，具有免疫原性低的特点，可降低免疫排斥反应的程度，但是通过干细胞诱导的RPE细胞存在致畸性和基因不稳定性的风险，因而干细胞来源的RPE细胞的生物安全性有待进一步研究。

表1 不同类型RPE细胞移植比较

Zhao等[33]对大鼠视网膜下腔注射2种细胞悬液进行比较，发现前部穿刺法造成晶状体损伤的风险较大，而后部经巩膜穿刺技术更精确，能直接到达RPE细胞移植的位置并且创伤较小，如何优化细胞悬液的注射方法还需大量实验进行探索。RPE细胞片在移植后易形成血-视网膜屏障，有助于患者视力恢复，但其所引起的黄斑皱褶等并发症也需要进一步观察和研究。此外，经过基因修饰的RPE细胞，可以用来治疗遗传性视网膜变性，有研究发现在RPE细胞中过表达OTX2基因可显著增强对光感受器细胞的保护作用[34]。国内有研究将过表达Fibulin-5基因的RPE细胞移植到激光诱导的CNV大鼠视网膜下腔，通过荧光素眼底血管造影观察发现过表达Fibulin-5基因的RPE细胞可以抑制大鼠CNV的发生，这可能为AMD治疗提供了新的思路[35]。另外，RPE细胞移植的细胞数量也需要优化，细胞数量过多不利于形成单层细胞，有研究发现当进行同种异体RPE细胞移植时，移植到每眼细胞数量超过50 000个会引起严重的急性免疫排斥反应[36]。Mehat等[37]对12例Stargardt病患者进行hESC-RPE细胞移植，发现在注射区域内出现的视网膜下色素沉着与注射的细胞数量呈正相关，但随访观察12个月内，未发现hESC-RPE细胞移植对视网膜功能恢复产生明显的有益作用。

综上所述，筛选更适用于移植的RPE细胞时需考虑以下因素：移植细胞来源(是否为干细胞来源)、供体细胞的年龄、移植细胞与RPE细胞的功能差异(即移植细胞的替代程度)、移植细胞的基因稳定性、移植细胞生理形态稳定性、移植细胞引发的受体免疫排斥反应的程度(免疫原性)、移植后是否易产生并发症及术后患者各项指标的恢复情况等。未来RPE细胞移植的趋势可能是建立对各种移植细胞的综合评价体系，以筛选合适的供体细胞。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突