非洲猪瘟疫苗研究进展

吴慧如，梁晓磊，邵洋洋，谢青梅，李鸿鑫

(华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由 ASF 病毒(African swine fever virus，ASFV)感染而引起的一种猪急性、烈性传染病，传播速度极快，死亡率可达100%，严重危害生猪养殖业[1]。ASFV属非洲猪瘟病毒科，是一种大型双链DNA病毒，长度从170 kb到190 kb不等。该病毒粒子呈二十面体对称，平均直径为260～300 nm，由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜，可编码不少于167种蛋白，且其中仍有多种蛋白质的结构和功能未确定。ASFV最早于1921年出现在肯尼亚，我国于2018年8月首次报道该病毒存在，现已扩散到全国各地并呈现蔓延态势，也是目前我国规定的一类动物疫病[2]。受其影响，2019 年我国生猪产能总体下降了约40%，生猪存栏量同比下降27.5%，能繁母猪存栏下降了约50%[3]。遗憾的是，因该病毒结构复杂、基因型多样以及对该病毒结构蛋白和非结构蛋白的结构和功能了解有限，尽管过去几十年已开展了多种类型疫苗研发，从灭活病毒、重组蛋白/肽和DNA疫苗到减毒活疫苗(LAV)候选物，但因候选疫苗保护效果不理想、副作用严重或临床试验未完成等原因，迄今为止仍未研制出针对ASFV有效的商品化疫苗[3]。面对日趋严峻的ASF疫情，安全有效的疫苗是防控ASF的亟需工具。本文总结了ASF灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒活载体疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗研究进展及其难点和突破点，为我国ASF疫苗研发和防控提供参考。

1 灭活疫苗

灭活疫苗是利用加热或甲醛等理化方法，使病原丧失感染能力和毒性而保留其免疫原性，并结合相应的免疫佐剂制备而成。灭活疫苗具有制备方法简单、价格低等优势，是很多疫病疫苗制备首选的工艺。ASF灭活疫苗早在1960年就开始研制，但已有的研究表明这类疫苗基本不能对ASFV感染起到保护作用[4]。即使使用高效新型佐剂，如Polygen(TM)或Emulsigen(R)-D配制ASF灭活疫苗，并在感染猪体内检测到了抗ASFV的特异性抗体，但仍不能诱导免疫猪产生保护性免疫反应，抵御不住ASFV的攻击，甚至可能出现症状加强现象[5-6]。因此，根据目前的研究结果显示ASF灭活疫苗无法提供有效保护效力。这可能与ASFV在宿主细胞内外具有不同的病毒生物学特性有关，在宿主细胞内外不同区域成熟ASFV粒子的病毒颗粒表面蛋白有着巨大差异，可能导致免疫原性改变从而影响灭活疫苗效果[7]。当然准确的、具体的原因还需要进一步深入研究。

2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是病原体经过各类处理后，毒性亚单位的结构发生改变，病原致病力减弱但仍保留其免疫原性的疫苗，具有使用剂量小、免疫持续周期长、成本低和使用方便等优点。猪感染ASFV耐受后能够一定程度抵抗ASFV再次感染，表明减毒活疫苗免疫可能对ASFV有保护效果。目前研制的ASF减毒活疫苗按来源可分为自然弱化活疫苗(包括连续传代致弱活疫苗)和重组致弱活疫苗。ASFV 可在Vero与CV1细胞内复制传代，并可通过连续传代来降低其毒力。Krug等[8]在Vero细胞系中连续传代ASFV-G株，至110代次时ASFV-G丧失毒力，但是弱化的ASFV-G株也丢失了保护性免疫抗原，即传代弱化的ASFV毒株因病毒外膜脂质的差异不具备毒株原本的中和活性，使得此类疫苗研发受阻。自然弱化的毒株代表为OURT88/3和HN/P86，该类毒株免疫猪群后可获得抗亲本毒株的免疫保护，并对不同基因型ASFV具有部分交叉保护，保护率为66%～100%[9-10]。其中OURT88/3可以抵御 OUR/T88/1、genotype X Uganda、Benin 97/1株的攻击，但是随着CD8+T淋巴细胞的消耗，会使免疫效果减退，造成不完全保护[9,11]；HN/P86可促进细胞毒性T淋巴细胞与NK细胞的活性，并抵御 ASFV/L60 强毒株的攻击但会引发部分猪群出现慢性感染现象[12-13]。虽然这些弱毒疫苗没有研制成功，但这些研究提示CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞在ASFV的保护性免疫中可能有重要作用。另外也有研究表明，不同免疫剂量对免疫效果也有影响[14]，提示免疫方式与剂量会对自然弱化活疫苗免疫效果产生影响。历史上自然弱化活疫苗最早于上世纪60年代在葡萄牙和西班牙开始使用，但随着疫苗的大量推广，免疫猪群出现越来越多的慢性ASFV感染，还出现了不同程度的副作用，主要症状包括关节炎、肺炎、流产、运动障碍及死亡等，后续研制虽然改进了疫苗的保护效力，但依然有出现低病毒血症或关节炎等副反应[9,12,15]。出于安全考虑，在没有解决这些副作用之前，自然弱化的ASF疫苗推广和使用会暂时受到限制。

重组致弱活疫苗是通过现代分子生物学技术对病毒的基因或结构进行改造从而实现病毒的毒力减弱，并以此制备成疫苗。现有研究表明ASFV在缺失TK、9GL、UK、EP402R、NL或MGF 360/505基因后，病毒仍具有较好的免疫原性且病毒毒力显著下降，以此制备为减毒活疫苗，可不同程度抵御不同来源的ASFV强毒株的感染[7,16-17]。TK基因缺失能致弱ASFV毒力，但不同毒株缺失TK基因后免疫原性有差异，Malwi和Gorigia缺失TK基因后致病力均减弱，但只有Malwi株诱导免疫猪产生保护性免疫反应[18]。流行毒株Georgia 2007/1敲除9GL和MGF360/505基因后病毒毒力减弱，但保护效果不理想，而当9GL和UK基因缺失时，却具有很好的免疫原性，该毒株制备成的减毒活疫苗能有效抵抗同源强毒株的感染，对不同基因型强毒株有一定的交叉保护效果[19]。BA71毒株缺失CD2v基因后，其毒力明显减弱，将其制备成的基因缺失减毒活疫苗同样对同源的强毒株具有强抵抗力，也对不同基因型毒株(如Georgia 2007/1)具有一定的交叉保护作用[20]。NL基因缺失同样可使部分毒株毒力变弱，当欧洲株E70缺失该基因后毒力完全致弱[21]。此外，缺失A224L、A238L、A276R基因的NH/P68毒株对多种基因型毒株也可提供保护(保护率为60%～100%)，但对部分猪免疫后产生病毒血症等副作用[22]。值得重点关注的是我国哈尔滨兽医研究所正在研发的七基因缺失ASFV疫苗进展顺利，通过敲除DP148R、EP402R、9GL、UK等基因使病毒毒力减弱，在完成实验室研究和中试工作后，于黑龙江、河南和新疆等地启动了疫苗临床试验，且免疫猪群后表现出良好的安全性和有效性[23]。目前，制约ASF重组致弱活疫苗研发的主要因素是ASFV毒力相关基因研究不足，但随着分子生物学技术的不断发展和优化，ASFV的各基因序列和功能将越来越清晰，可通过DNA重组技术、病毒反向遗传操作及基因编辑等技术进行基因组序列定点替换或敲除，实现对目标病毒关键毒力基因的改造(缺失或修改)，促使毒株致弱、变安全，从而得到候选疫苗株。综上研究，ASF重组致弱活疫苗可能会是我国最早实现商品化供应的候选疫苗。

3 病毒活载体疫苗

重组活载体疫苗是利用基因工程技术将编码病原体保护性抗原的基因插入活载体中并使之表达的活疫苗，主要包括重组病毒载体活疫苗和重组细菌载体活疫苗。其兼具灭活疫苗的安全性和活疫苗的效果好、成本低等优点。目前常作为动物病毒重组活载体疫苗的载体有：痘病毒活载体、疱疹病毒活载体、腺病毒活载体、新城疫病毒活载体及水泡性口炎病毒活载体等[24]。以痘病毒、腺病毒、甲病毒和新城疫病毒为表达载体的ASFV活载体疫苗也已广泛开展。Jancovich等[25]通过痘病毒载体鉴定出47种ASFV保护性抗原，并筛选出能有效刺激机体体液免疫和细胞免疫的p30、p72等抗原，以痘病毒为载体制备了候选疫苗，但因免疫猪群有严重的副反应，需进一步改进。Netherton等[26]通过ASFV OUR/T33株预测出133个抗原肽，并从中筛选出能激活细胞免疫反应的肽段，以此肽段对应基因构建腺病毒和痘病毒载体疫苗，免疫猪群可明显降低血液中病毒滴度，但未能起到攻毒保护作用。Lopera-Madrid等[27]将ASFV的p72、p54、p12、EP153R、EP402R分别插入减毒牛痘病毒载体中构建重组病毒表达ASFV多个抗原，采取“鸡尾酒”式混合免疫和加强免疫猪群，可诱导针对ASFV抗原的强烈抗体反应和T细胞反应。Lokhandwala 等[28-29]通过构建人5型腺病毒载体和复制缺陷型腺病毒载体表达ASFV保护性抗原基因(p32、p54、p62和p72)，同样以“鸡尾酒”式混合免疫猪群，也诱导了强烈抗体反应。Murgia等[30]利用甲病毒载体分别构建表达ASFV p30、p54、p72抗原的载体，并通过Vero细胞进行病毒拯救，最终找到了免疫原性特别强的重组毒株ASFV p30。Chen等[31]将ASFV的p72基因插入新城疫病毒构建重组病毒，并证实该重组病毒能在鸡胚中复制，在免疫小鼠中可产生高抗体，且能诱导T细胞增殖和分泌IFN-γ和IL-4。但上述研究均尚未有完整的猪群攻毒保护试验数据，免疫效果需进一步验证。病毒活载体疫苗能诱导免疫动物产生体液免疫、细胞免疫，甚至黏膜免疫，载体中还可以插入多个外源基因(可以是不同病原的抗原基因)并同时表达，是多价疫苗和多联疫苗的开发的重点方向，并能利用成熟的疫苗载体快速制备新发毒株或流行毒株的载体疫苗候选毒株，缩短研制周期，提高保护效果。因此，病毒活载体疫苗是未来ASF疫苗研发的重点方向。

4 亚单位疫苗

亚单位疫苗是通过可控制性的蛋白质分解或水解方法，再纯化、筛选出具有免疫活性的片段制成的疫苗。该类疫苗克服了传统减毒活疫苗毒力返强问题以及灭活疫苗灭活不完全的安全性问题，是目前尚不能培养或繁殖有困难的病毒相关疫苗研发的重要途径。ASF亚单位疫苗是将特定ASFV保护性抗原基因在合适的系统中进行亚单位表达，纯化制备成疫苗，可诱导免疫猪群产生针对ASFV的保护性中和抗体。但ASFV可编码167种蛋白，使得保护性抗原筛选变得非常困难。而且ASFV蛋白结构、功能复杂，有些蛋白既是病毒中和靶位也具有诱导机体产生保护性免疫的潜能。目前，已证实ASFV p30、p54、p72 和CD2v等蛋白是病毒粒子重要的免疫原[32-34]。利用重组杆状病毒表达CD2v蛋白所制备的疫苗对同源的ASFV强毒株具有部分的免疫保护效果[35]。利用杆状病毒表达p12蛋白所制备的亚单位疫苗能够以剂量依赖的形式抑制ASFV在猪肺泡细胞上的增殖，但无法提供免疫性保护[36]。用p30或p54蛋白所制备的亚单位疫苗可诱导免疫猪产生中和抗体，但没能改变病程，也没能阻止免疫猪群的感染死亡，而用p30和p54联合制备的疫苗，可使免疫猪群体内产生中和抗体，并在一定程度上改善病程，实现部分免疫保护作用[37]，提示ASFV不同的蛋白组合或抗原数量会影响保护效果。但利用重组杆状病毒同时表达p30、p54和 p72蛋白所制备的亚单位疫苗免疫猪群后仍无法抵御ASFV强毒攻击[38]。而Ruiz-Gonzalvo等[35]利用杆状病毒表达CD2v、p54和p30蛋白来免疫猪群可诱发猪体不仅产生中和抗体，而且攻毒后全部存活下来，可惜免疫猪群可能会出现病毒血症。表明ASFV的p72、p54、p30等蛋白诱发产生的抗体，能够在一定程度上中和病毒，抑制病毒复制过程。另外，ASFV蛋白结构复杂也可能是影响亚单位疫苗免疫效果的重要因素，如p72蛋白作为感染猪体内能检测到的主要抗原之一，体外单独表达的p72蛋白会出现错误折叠构象，只有在辅助蛋白B602L共同表达时才可能得到正确折叠构象的p72蛋白。这些研究提示制备ASF亚单位疫苗时需要注意ASFV抗原蛋白的选择、组合及种类。随着ASFV编码蛋白功能的研究越来越多，通过选择合适的基因及合适的载体研制亚单位疫苗是能够获得成功的。

5 DNA疫苗

核酸疫苗是将含有编码抗原蛋白的外源基因直接导入宿主细胞内，并利用宿主表达系统合成特异性抗原蛋白，激活宿主的细胞或体液免疫，以达到预防和治疗疾病的目的疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前开发的核酸疫苗主要为DNA疫苗。与传统的灭活疫苗或减毒活疫苗相比，DNA疫苗具有安全、高效、制备便捷等潜在优势，特别是可通过对靶基因的改造从而选择抗原决定簇，人为实现同种异株交叉保护的疫苗株出现。前期研究已表明CTL免疫反应在疫苗抗病毒过程发挥着重要作用[9,11-13]，而DNA疫苗在诱导细胞介导的CTL免疫反应上效果显著。Argilaguet 等[39]将编码p54和p30基因的真核表达质粒制成DNA疫苗，免疫猪群时既不产生T细胞反应也无法抵抗ASFV强毒的攻击。用编码猪白细胞抗原基因SLAII与p30/p54融合的DNA疫苗免疫猪群则能产生广泛的免疫反应(包括特异性抗体和T细胞)，但不能诱导抗病毒性感染的中和抗体，将CD2v、p30和p54组合免疫猪群也可以增强体液和细胞免疫，但也无法提供免疫保护，然而将p30、p54、CD2v和泛素基因串连起来制备为DNA疫苗，可强烈诱导免疫猪群产生细胞免疫，并给免疫猪群提供了攻毒保护效果(无检测到抗体产生条件下)，再次证明细胞免疫在疫苗抗病毒中发挥的重要作用[40]。为进一步刺激CD8+T细胞的潜在免疫保护区，Lacasta等[41]构建了几千个表达质粒，通过DNA表达文库识别参与ASFV保护性免疫的T细胞靶点，并以此制备成DNA疫苗免疫机体，但攻毒保护率仅60%，而幸运的是免疫攻毒后存活的猪群没有出现排毒现象。这些研究表明T细胞在ASFV刺激机体产生的免疫保护中发挥重要作用，ASFV存在多种具有潜在保护能力的抗原。但目前已报道的可应用于构建DNA疫苗的ASFV保护性抗原仍不足以对免疫猪群提供完全保护。未来ASF DNA疫苗的研发，需要对ASFV未知的保护性抗原进行更全面筛选和研究。寻找出更适合的保护性抗原以及优化表达载体，有效结合体液免疫和细胞免疫，提高疫苗的保护率。

6 小结

从ASF发现至今已近百年，对养猪行业更是带来了无比沉重的打击，但对ASFV各方面的研究和认识还急需进一步探索。虽然在ASFV基因的功能结构、入侵方式及宿主抗ASFV免疫反应等方面取得了一定成果，也尝试开发了多种疫苗，但都因为不能提供完全保护或存在不良反应等副作用而无法推广。以目前的研究进展看，减毒活疫苗能相对完整地保留病毒结构，可在猪群体内正常复制，刺激机体产生中和抗体，且能显著控制病毒毒力，成为最有希望可以实现的高效、安全、商品化的ASF候选疫苗。随着现代分子生物学技术发展和对ASFV致病机制、免疫逃逸机制、毒力基因等研究、认识的不断加深，更加可靠的、可控的非洲猪瘟疫苗将会在不远的将来成功面世。