儿茶素类物质按聚合度分离分析方法研究进展

刘彦霞 *，秦菲

1. 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室（北京 100191）；2. 北京联合大学功能食品科学技术研究院（北京 100191）；3. 北京联合大学生物化学工程学院（北京 100023）

儿茶素类物质是植物次生代谢产物，广泛存在于多种植物中，如茶叶、葡萄、苹果、柿子等。因为儿茶素类物质具有多种生理功能，多年来受到科研工作者们的关注，有大量关于儿茶素类物质提取、分离、代谢及生理功能方面的研究[1-3]。在自然界中，儿茶素类物质以儿茶素单体和聚合体混合存在，其聚合体一般又称作原花青素（前花青素）或缩合单宁。聚合度是儿茶素类物质分子结构复杂性的一个重要表现，不同聚合度儿茶素的吸收、代谢及生物利用度有明显区别[4-5]，目前大多数研究认为聚合度低的儿茶素具有更高的生物利用率。研究者对不同聚合度儿茶素进行分离分析的方法进行过大量尝试。综述近年来儿茶素类物质按聚合度分离分析的方法进行，以期为此类物质的进一步研究提供参考

1 儿茶素类物质常用提取、定量分析方法

因为植物成分的复杂性，按聚合度对儿茶素类物质的分离分析首先要进行提取，将其与植物其他成分分开，在按照聚合度分离之前进行儿茶素类物质总量的测定。儿茶素单体以C6-C3-C6为骨架结构，C环上C2与C3为两个手性碳原子。根据其取代基团及位置不同，常见的儿茶素单体有8种。如果儿茶素多聚体中所有结构单元和连接键都随机组合，那么由其组成的多聚体的异构体个数将会随聚合度的增大，以指数方式增长[6]，想要分离聚合度3以上的儿茶素聚合体的纯品已经非常困难。

1.1 儿茶素类物质常用提取方法

儿茶素类物质最常用的提取方法是有机溶剂提取法。在植物原料中，儿茶素类物质通常与植物组织中其他成分如蛋白质、果胶等物质通过氢键结合存在。用有机溶剂提取能够使氢键断裂，常用的有机溶剂有甲醇、丙酮、乙醇，这些溶剂按一定比例与水混合作为提取溶剂。在以分析植物原料中儿茶素类物质成分为目的的研究中，常以70%丙酮作为提取溶剂[7-8]。有研究发现，在提取溶剂中加入约50%的丙酮，能大大提高可溶性和不可溶性儿茶素聚合体的提取[9]。另外，仪器协助提取，如超声协助提取[2-3]、微波协助提取[1]、超声微波协同处理[10]、超声波-酶法辅助处理，可以增强植物细胞壁的通透性，提高提取效率[11-12]。研究发现，微波处理能够增加单体儿茶素及儿茶素类物质的提取总量，所得产物具有更高的抗氧化能力和葡萄糖苷酶抑制活性[1]。超临界CO2萃取是利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，将目标成分提取出来。这种方法提取效率与产品纯度均较高，且能有效地防止儿茶素类物质的氧化，但是由于仪器设备一次性投入高，应用受到限制。近年来出现一些新的提取溶剂或提取方法，如乙醇-硫酸铵双水相萃取[13]、分散液-液气溶胶相萃取法[14]。乙醇-硫酸铵双水相系统具有较好的分离效率且便于回收，酶的使用促进了植物细胞的破壁，与索氏提取方法相比，总酚得率提高64.91%。分散液-液气溶胶相萃取法中气溶胶大大增加了互不相容的两相之间界面的表面积，加快了分配平衡的速度，与传统提取方法相比，缩短了提取所需时间，且减少了试剂用量，更加环保。

1.2 儿茶素类物质常用定量分析方法

儿茶素类物质总量测定方法主要采用的是紫外分光光度法，包括福林酚（Folin-Ciocalteau）法、香草醛-盐酸（硫酸）法、铁盐催化正丁醇-盐酸（Butanol-HCl）法、钼酸铵法、二甲基氨基肉桂醛（DMACA）测定法[15-17]。福林酚法利用钨钼酸氧化其他物质，本身被还原的性质，以没食子酸作为标准进行定量，儿茶素以外具有还原性的物质也会参加反应，因此所得到的结果会偏高，但目前仍是常用的定量方法[7-8]。香草醛-盐酸（硫酸）法与DMACA能够与儿茶素单体反应，以儿茶素单体作为标准品，可以得到总儿茶素类物质的含量。而正丁醇-盐酸法则测定的是儿茶素聚合体即原花青素的含量，其中不包括儿茶素单体，一般用纯度较高的原花青素作为标准品。

反相高效液相色谱（HPLC）法，可以高效分离单体及低聚体儿茶素，在有标准品的情况下，能够同时检测多种儿茶素物质的含量[18-20]。然而对聚合度3以上的儿茶素聚合体，由于异构体数目呈几何倍数的增加，反相HPLC很难进行分离，这些聚合度较高的儿茶素在色谱图中形成大的色谱峰包。正是利用反相HPLC对儿茶素的高分辨效果，研究者将儿茶素聚合体在酸性条件下水解产生花氰定，然后利用HPLC对产生的花氰定进行检测，也能够对儿茶素的总量进行定量[21]。保健食品中前花青素的测定的国家标准GB/T22244—2008即采用该方法。

2 儿茶素类物质聚合度的测定方法

儿茶素单体和部分商业化标准品的低聚体可以通过标准物质进行定性，但这只是儿茶素类物质中很小的一部分，绝大多数儿茶素类物质聚合体是没有商业化的标准物质的。质谱与核磁共振技术（NMR）是儿茶素类物质聚合体定性分析的有效方法，电喷雾离子化质谱（ESI MS）和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）在儿茶素类物质分析中占有重要位置。通过MALDI-TOF MS分析，结果发现草莓果皮中有儿茶素13聚体[8]，黄皮树叶片中最大聚合度达到20[22]，通过与MALDI-TOF MS与NMR联合分析，结果发现蔓越莓汁中存在A型原花青素3-6聚体[23]。

平均聚合度（mDP）是另一个用于了解样品中儿茶素类物质聚合情况的概念，mDP是由儿茶素混合物中总组成单元的分子个数除以总的儿茶素类物质分子个数而得来的，可以粗略地反映出儿茶素混合物的聚合程度[24-25]。目前测定平均聚合度的方法主要有3种。

2.1 裂解分析法测定mDP

在亲核试剂如苄硫醇存在时，儿茶素聚合体发生部分硫解反应，硫解后主要形成其单体结构及相应的苄硫醚衍生物，聚合体的底端单元反应后形成儿茶素单体形式，而儿茶素聚合体的延伸结构单元以苄硫醚衍生物形式存在[26-28]。因此，该方法还可以检测出聚合体的组成单元。苄硫醇因为有特殊气味，常用间苯三酚取代。利用HPLC对产物进行分析，儿茶素单体物质可以通过标样定性定量得到实际的摩尔数，其苄硫醚（或间苯三酚）衍生物可以通过自制的标准品，或者用儿茶素单体标准品相对定量，计算其摩尔数。通过这种方式，mDP=（底端单元摩尔数+延伸单元摩尔数）/底端单元摩尔数[29]。也有直接用所得产物的峰面积作为分子个数代表进行计算平均聚合度的研究[30]。

2.2 香草醛-盐酸法测定mDP

香草醛盐酸法以甲醇为溶剂，香草醛能够跟多聚体中每个组成单元发生酚醛缩合反应，能够得到儿茶素聚合体的质量浓度。而以乙酸为溶剂时，香草醛只与末端儿茶素单元发生缩合反应，这样可以得到儿茶素聚合体的摩尔浓度。这种方法在20世纪80年代提出[31]，至今已在多种植物原花青素的研究中应用，并对盐酸浓度、反应温度、反应时间等影响反应的因素进行了优化[25,32]。

2.3 黏度法测定mDP

黏度法是测定高聚物分子量的方法，可用于测定溶液中大分子的聚合度，曾用于聚乙二醇、氧化聚乙烯蜡、壳寡糖等物质分子质量的测定。所用设备相对简单、操作比较方便。赵平等[32]、刘亚静[33]利用黏度法测定原花青素聚合度，使用乌氏黏度计测定不同原花青素样品的流出时间，从而得到各样品的特性黏度。再结合Mark-Houwink方程，确定比例系数K和扩张因子α，得到各样品聚合度。研究证实用黏度法检测得到的原花青素样品聚合度于香草醛-盐酸分析方法相当。

目前，更多研究综合利用MALDI-TOF MS、ESI MS、NMR、裂解分析、HPLC等技术，对样品中的儿茶素类物质进行分析[7,22,34-35]。

3 儿茶素按照聚合度进行分级分离的方法

按照聚合度对儿茶素进行分离纯化的方法主要有两类：一是根据聚合度不同的儿茶素的极性不同，溶解性不同，采用不同极性的有机溶剂进行梯度沉淀或洗脱，将聚合度不同的儿茶素分离开；二是利用色谱技术，通过分子筛、吸附色谱、液液萃取技术等将不同聚合度的儿茶素类物质分开。

3.1 利用儿茶素在不同溶剂中具有不同溶解度的性质

Labarbe等[36]利用氯仿/甲醇（75：25，V/V）将大部分单宁沉淀后，将儿茶素类物质沉淀置于一个惰性玻璃粉（200～400 μm）柱子顶部，然后逐渐增加洗脱液中甲醇的比例，将其分成不同部分。对各个部分进行定量且经间苯三酚酸性裂解后进行定性分析。对总的提取物及各部分的检测数据表明：这种方法可以达到定量的分离，同时也能够监测聚合度分布及其他的成分组成（原翠雀定的比例、酰化率）。分离后葡萄籽儿茶素类物质各部分的平均聚合度在4.7～17.4之间（总提取物为8.1），葡萄皮中其平均聚合度在9.3～73.8之间（总提取物为34.9）。该方法能够在不经前处理的情况下对较高聚合度的儿茶素类物质进行定量和定性的分析。

Saucier等[37]利用儿茶素类物质在不同溶剂（水、乙酸乙酯、甲醇和氯仿）中的溶解度不同，先用乙酸乙酯将葡萄籽提取液水相中的低聚体萃取出来，剩余水相旋转蒸发，冷冻干燥后溶于甲醇，逐次加入氯仿，使氯仿占整个溶液体积的50%，60%，70%和75%，分次收集每次得到的沉淀，溶于甲醇。经HPLC及凝胶色谱分离得到的不同组分，分析其平均聚合度及分子量。

Perret等[38]采用苯乙烯-二乙烯基苯柱，经甲醇-氯仿的梯度溶液洗脱，增加洗脱液中甲醇的比例可以使更高聚合度的儿茶素溶解。从葡萄浆果中提取出的多聚儿茶素按照聚合度进行了分离。将收集到的各组分在亲核试剂的作用下酸性裂解，结果发现所得各部分的mDP值从1.84至19.34呈线性增加。用MALDI-TOF MS进行半定性分析，其波谱显示为儿茶素类物质的混合物。

3.2 利用色谱法对不同聚合度儿茶素进行分离

3.2.1 凝胶色谱柱分离

Sephadex LH-20和Toyopearl HW凝胶色谱多年来常用于儿茶素类物质的纯化分离，通过不同比例甲醇和丙酮的梯度洗脱分离儿茶素聚合体，其作用原理有分子筛效应，但以吸附作用为主[7-8]。Taylor等[39]从啤酒花中提取原花青素，测得其mDP为7.8，MALDITOF/MS中可见的最大低聚体的聚合度为7。用sephadex LH-20柱，经甲醇、水和丙酮梯度洗脱，将粗提物按照聚合度进行分离，在聚合度最高的组分中利用质谱检测到了聚合度为20的聚合物，证明了预先分离在改进MS检测中的有效性。Li等[8]利用sephadex LH-20柱对草莓果皮中的儿茶素类物质进行分离，首先用50%甲醇洗去酚酸、糖苷、儿茶素单体后，以90%甲醇（V/V）开始，逐渐减小甲醇的比例，提高丙酮的比例，以70%丙酮（V/V）结束，将儿茶素聚合物分成五部分。经裂解分析这五部分平均聚合度依次为2.06，3.32，5.75，7.72和10.6。然而聚合度较高的儿茶素聚合体的MALDI-TOF-MS的信号明显低于低聚体，有可能质谱的信息不能完全反映真实的聚合体分布情况。Li等[40]采用TSK HW-50F对柿子皮中的儿茶素类物质进行分离，依次用1：4，2：3，6：4的丙酮/甲醇（V/V）洗脱，三部分的平均聚合度分别为19，37和47。

3.2.2 C18固相萃取柱

Sun等[41]首次采用C18Sep-Pak柱按照聚合度将葡萄和葡萄酒中儿茶素类物质进行分离。首先用中性磷酸缓冲液除去酚酸，然后用乙酸乙酯洗脱得单体与寡聚体，柱子上吸附的多聚体用甲醇洗脱收集，之后再分离单体与寡聚体。利用这种方法[42]，研究者对不同葡萄品种酿制的葡萄酒、扁豆皮中的儿茶素类物质按照聚合度分成单体、寡聚体和多聚体三部分。

3.2.3 大孔树脂

AB-8树脂[30]对葡萄籽原花青素具有吸附量大、解吸率高、选择性好等特点，适于分离并得到纯度较高的葡萄籽原花青素。对其分级分离特性的研究表明，采用AB-8树脂吸附分离原花青素，通过逐步提高乙醇体积分数（10%～50%），可以将原花青素按聚合度由低到高的顺序依次洗脱下来，从低体积分数乙醇洗脱液中可以得到低聚体含量相对较高的原花青素组分。

3.2.4 薄层色谱法

Glavnik等[43]利用溶剂乙腈和甲苯：丙酮：甲酸（3：6：1，V/V），在日本虎杖根茎中初步鉴定了单体、单体没食子酸盐、二聚体、三聚体直至十聚体。乙酸乙酯可从单体分离到六聚物没食子酸酯，而乙酸乙酯-甲酸乙酯（9：0.1，V/V）可从单体分离到六聚物。

3.2.5 利用NP-HPLC进行分离

用正相色谱高效液相色谱（NP-HPLC）可成功地将儿茶素类物质按照聚合度从小到大依次分离开。Gu等[44]采用硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇-甲酸-水混合为流动相梯度溶液，将聚合度为1～10的原花色素按照聚合度从小到大依次被洗脱出来，而聚合度大于10的原花色素以一个大峰最后出现。利用二醇固定相柱，酸化乙腈和甲醇-水作为流动相进行梯度洗脱，荧光检测器，也可将可可豆中的原花青素按照聚合度分离，并进一步将方法扩展到制备水平[45]，该方法被用于样品材料包括黑巧克力和牛奶巧克力、可可制品中原花青素的分析[46]。Pedan等[47]建立了一种NP-HPLC-online-DPPH分析方法，用于分离同源系列的原花青素，同时评价其抗氧化能力与聚合度的关系。

3.2.6 高速逆流色谱

以上色谱分离技术利用不同凝胶作为固定相，难以避免固相载体对儿茶素类物质的吸附效应。而高效逆流色谱（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC）无需固态载体，是将样品分配于两相互不相溶的溶剂中，通过多层螺旋管的同步行星式离心运动，实现目标物的分离。其优点是没有载体吸附问题，进样量可以达到毫克甚至克量级、回收率高[48]。Zhang等[49]通过优化HSCCC条件，将葡萄籽提取物中的儿茶素类物质按平均聚合度由1.44～6.95依次分离为7个不同的馏分，而且产率较高，同时还获得17种商业难以获得的纯度较高的原花青素纯品。

4 儿茶素按照聚合度分级分离方法研究的困难与展望

虽然目前已经有以上多种按照聚合度对儿茶素类物质进行分级分离的方法，但因为此类物质大量异构体的存在，对其组成成分的分析异常复杂，每一种方法都只能提供某一方面的信息。目前，对于这类物质的分析，一般是先经过提取得到粗提物，然后利用溶解度分级沉淀或用不同溶剂分步骤洗脱柱色谱进行初步的分离纯化，得到聚合度不同各部分。进一步通过质谱（ESIMS或MALDI-TOF/MS）进行分析，以了解儿茶素聚合体所达到的聚合度，及聚合度的大概分布。同时对聚合度不同的各部分进行裂解分析可以得到其平均聚合度及其构成单元，包括底端单元和延伸单元、棓酰化程度等信息。然而即使是通过这一系列复杂的分析步骤，在现有技术下要清晰了解某一体系中儿茶素类物质的组成成分仍然是难以实现的。

即便如此，研究人员已经利用现有技术方法对大量植物中儿茶素的组成进行了研究分析，认识到不同聚合度儿茶素、组成单元不同的儿茶素本身具有不同的生物利用度，而且利用这些材料制成的食品口感也因为聚合度和组成单元不同而有差异。对儿茶素类物质结构、组成、生理功能与结构的关系等研究需要我们在儿茶素类物质结构分析技术方面取得进一步的突破。