慢病毒载体系统研究及应用进展

张 慧，曹胜亮，刘思当

(山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

慢病毒(lentivirus)是一种具有特殊性质的病毒，致病过程缓慢，能将自身致病基因整合到宿主基因组中，且在宿主表现临床症状前能潜伏感染数年之久。科研人员利用这种天然优势，开发了慢病毒载体(lentiviral victors，LVs)。慢病毒载体是一种经过基因改造的病毒载体，在剔除慢病毒致病因子的同时，保留其基因组能整合到宿主基因组的能力，可携带各种外源性基因或改造基因整合至宿主染色体中达到稳定表达的目的[1]。最初慢病毒多感染淋巴细胞、巨噬细胞，现经改造后可感染神经细胞、肝细胞、脑细胞等多种组织细胞。目前，慢病毒载体作为生物疾病研究中的重要载体，被广泛运用在肿瘤治疗、基因调控、通路研究、免疫等各个领域。

1 慢病毒载体分类及结构组成

1.1 慢病毒载体分类目前使用的慢病毒载体属于逆转录病毒家族，包括早期的人Ⅰ型、Ⅱ 型免疫缺陷病毒(HIV-Ⅰ、HIV-Ⅱ)载体，以及后期不同种属的猿类免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)载体、猫免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus,FIV)载体、马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)载体、山羊类关节炎-脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)载体、牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency birus,BIV)载体等。不同种属载体的出现意味着针对相应动物疾病的研究增加了更多选择，也能有效提高感染效率和成功率。

1.2 慢病毒基因组结构慢病毒基因组结构与逆转录病毒的基本结构组成相同，包括gag、pol、env基因及3′和5′LTR，其中gag编码核心结构蛋白，pol编码整合到宿主细胞基因组过程中所需的酶，env编码包膜蛋白，LTR包含顺式作用元件及病毒包装信号[2]。以应用最早、最广泛的HIV载体为例， HIV核心蛋白由gag和pol基因编码，gag编码病毒衣壳(CA)、病毒基质(MA)、病毒核衣壳(NC)，pol编码蛋白则水解成3种病毒酶：蛋白酶(PR)、病毒逆转录酶(RT)和病毒整合酶(IN)，共同构成病毒核心成分。env基因编码gp160前体蛋白，被加工切割为gp120亚基和gp40三聚体，构成病毒的脂质外膜衣壳。在许多情况下，在载体中env基因编码蛋白功能会被另一种蛋白质取代，以扩展载体的取向性。除此之外病毒基因组还编码调节蛋白Tat和Rev，它们分别激活病毒转录并控制病毒转录物的剪接和核输出[3]。另外4个基因编码辅助蛋白Vif、Vpr、Vpu和Nef，这些产物是HIV在体内感染所必需的[4]。

2 慢病毒载体发展历程

慢病毒载体系统最初是通过提取人类免疫缺陷病毒(HIV)基因组，并在其中添加反式的HIV多蛋白来构建的[5]，最早用于筛选HIV的治疗药物及靶向位点，后来在保证科研安全的前提下，被用于基因改造研究。该系统构建的基本原则是删除病毒的毒力基因，将负责病毒颗粒包装的反式作用元件、病毒包装信号等分离，并使其具有携带外源基因的能力。

慢病毒发展到今日共经历了4代转变。第1代慢病毒以HIV为基础，保留了基本基因结构，为避免病毒粒子进行自我包装，将3′LTR、U3区的增强子和启动子序列删除，使病毒本身的LTR启动子转录失活，但是不足之处是这种慢病毒滴度较低，且由于其识别位点受限主要侵袭CD4+细胞。第2代慢病毒载体将其包膜蛋白经过改造，由水泡性口炎病毒G(VSV-G)蛋白代替，能够识别一种广泛膜受体-低密度脂蛋白受体(LOL)，促进病毒内吞，使慢病毒能够轻松进入多种细胞中，同时病毒滴度可增至1 000 倍，扩大了慢病毒的适用范围。第3代慢病毒载体在第2代的基础上删除了辅助基因vif、vpr、vpu和nef，进一步提高了安全系数。第4代慢病毒载体是目前应用最广、最成熟的慢病毒系统，组装构建过程分为四质粒部分，其中慢病毒转移载体质粒部分携带需要转入的基因片段，另外3个质粒(pMDL、pRev和pVSVG)则负责提供包装所需的反式作用因子。质粒pMDL编码Gag-Pol前体蛋白，最终被加工成整合酶、逆转录酶和结构蛋白；pRev与转移载体中的顺式作用元件(RRE)相互作用，增强未经酶切的全长基因组转录本的输出；在病毒包膜中存在VSVG使病毒颗粒具有转化多种细胞类型的能力[6]。通过将这4个质粒混合后转入同一细胞表达株内进行包装，最终获得表达完整的慢病毒载体。同时该载体系统中进一步剔除了活性 LTR、Tat 或辅助蛋白，长末端重复序列的增强子或启动子也被删除，转而添加土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，在显著增加生物安全性的同时提高了转导效率[7]。

3 慢病毒载体系统的应用

将外源基因转入细胞中涵盖多种方法，包括热激、磷酸钙、脂质体转染、显微注射、电穿孔、基因枪等，但这些方法都具有一定的局限性。慢病毒载体转染效率高，可携带的基因片段大(>9 kDa)，能够感染分裂期与非分裂期的多种细胞，且能实现长期稳定表达[8]。随着目前表达载体的多样化及可改造性，在研究中得到了广泛的应用，为科研提供了便利。

3.1 构建稳定表达细胞系慢病毒载体能侵染各类细胞，且可携带荧光标记等信号，是构建细胞系的常用有效载体。利用慢病毒作为载体，筛选出的细胞系除了为科研提供基础试验材料，也具有重要的临床应用价值。例如，可以分析基因的潜在功能，科研人员利用慢病毒载体将脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)导入小尾寒羊成纤维细胞系，发现该基因能够显著提高肉质，可以作为转基因肉羊候选基因[9]；可筛选稳定转染细胞并导入体内进行标记示踪，追踪细胞及胚胎发育分化过程，目前在人、猪、兔、马属动物等多种细胞中均有开展应用[10-12]；使用人抗病毒基因MxA重组慢病毒感染的鸡精原干细胞，移植至受体后能够继续分化为精子，最后利用体外授精技术可以进一步获得抗病毒转基因鸡[13]。

3.2 疾病治疗

3.2.1RNA干扰技术 RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一种小分子双链RNA介导的分子沉默机制，可以高效下调目的基因表达，是抗病毒治疗的新手段。慢病毒载体作为RNAi研究的有效辅助手段，可以感染各种分裂时期细胞并实现稳定表达。在了解病毒毒力蛋白的基础上，以慢病毒为载体构建靶向某个病毒致病基因位点的shRNA 进行细胞试验或动物回归试验，通过检测mRNA复制水平及病毒滴度测定等方法可以确定基因沉默效果及对病毒复制能力的抑制情况。杨少华等[14]在鸡胚成纤维细胞和SPF鸡胚中进行干扰试验，确定了抑制 NDV增殖的shRNA 靶点RNAi-341和RNAi-671；齐兴才等[15]以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作为靶基因，初步筛选了2个最佳抑制位点能够降低口蹄疫病毒的复制效率。

3.2.2靶基因及通路筛选 病毒侵袭宿主需要特定受体位点识别，并与靶基因相互作用激活信号传递、物质代谢、周期调控等复杂信号通路，利于病毒在宿主体内复制生存，因此找到靶基因可为病毒疾病治疗提供了一条新思路。慢病毒载体体系表达率高，可携带基因片段较长，极少诱发宿主产生免疫反应，是筛选靶基因的理想表达载体。例如在肿瘤疾病研究中，信号靶点是研究热点，利用慢病毒体系进行信号靶点的筛选省时省力。张名媛等[16]构建以广西巴马小型猪为模型动物的miR-148b慢病毒表达载体，利用软件辅助对其作用靶基因及相关通路进行了预测分析，为后续的功能研究及miRNA肿瘤治疗药物开发等提供理论指导。

3.2.3基因治疗 基因治疗是指将外源基因导入细胞中，纠正或弥补由于基因缺陷所造成的疾病。导入的外源基因主要分为正常基因、治疗基因和“自杀基因”[17]。转入正常基因或是能够发挥正常功能的该基因片段，可以弥补先天性的基因缺失从而发挥治疗作用，主要用于各类遗传病的治疗；而治疗基因主要是指转入对疾病具有明显治疗效果的靶基因，例如在小鼠慢性糖尿病疾病模型中，利用慢病毒载体在人脐带间充质干细胞内转入携带热休克蛋白90α功能性F-5基因，可以减少慢性创面愈合时间，加快组织修复[18]；“自杀基因”主要指胞嘧啶脱氨酶基因(CD)和编码胸苷激酶的基因(TK)，可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，杀死受体细胞。家婷等[19]构建HSV-TK/CD20双自杀基因系统慢病毒载体，靶向诱导人外周血T细胞实现自我清除，为消除过度免疫治疗产生的不良反应提供可控性。

3.3 疫苗研发当疾病发生时，疫苗免疫防控是避免其大规模流行的有效方式，在人及动物传染病预防治疗中均发挥重要作用。早期，研究人员发现逆转录病毒和慢病毒具有基因组整合能力，都是有效的病毒载体，相比之下，慢病毒载体能感染非分裂细胞，也无需直接靶向致病性抗原，可用于抑制自身免疫性疾病，是更加理想的载体[20]。成功接种疫苗的一个标志是诱导强而持久的记忆性T细胞反应，慢病毒载体具有持续高水平的抗原表达能力，产生大量功能分化的效应记忆T细胞，更利于控制类似HIV等早期感染病毒[21]。与广泛使用的腺病毒载体相比，剔除整合特性的缺陷型整合慢病毒载体主要的靶细胞是不分裂树突状细胞(DC)的，规避了插入突变的安全性问题，为治疗性疫苗接种提供了巨大的潜力，提示在大规模预防性疫苗接种中使用的可能性[22]。国外针对猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)及人艾滋病(AIDS)等已都进行了成熟的慢病毒疫苗研发及机制研究[23-25]。马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是国内首次成功应用的慢病毒疫苗，通过对减毒活疫苗株多个基因的多重突变减弱其致病力，使用该疫苗进行的大规模免疫接种对中国马传染性贫血疾病的预防和控制做出了巨大贡献[26]。

3.4 生产转基因动物转基因动物是分子生物学的拓展研究领域，也是生命科学研究领域重要的辅助科研手段。1978年美国科学家利用胚胎注射技术将生长激素导入小鼠受精卵获得了世界首例转基因动物，之后体细胞移植法生产的克隆羊“多利”使转基因动物走进了大众视野。转基因动物生产技术发展至今已有显微注射技术、逆转录病毒感染法、体细胞核移植法等多种成熟的技术方法[27]，其中以慢病毒作为载体，利用显微注射技术将外源基因导入动物胚胎中可以显著提高目的基因稳定表达率，甚至可以实现稳定的遗传性状，降低转基因动物生产成本，吸引科研学者在猪、牛、羊等多种动物体中开展以该方法为基础的转基因动物试验。鼠是人类疾病研究的首选模型动物，借助慢病毒载体生产特定组织转基因鼠也是最常见的技术手段。对于鼠、猪、牛等哺乳动物，通过向未发育的受精卵卵周隙注射慢病毒载体颗粒再植入代孕母体子宫的方法，最终能够获取需要的转基因动物[28]。而禽类技术相对较复杂，需要在卵壳膜气室上面开1 m3小窗，将病毒液直接注射到卵黄上、下膜层之间，将卵壳膜使用透气胶带封口，放入孵化箱至破壳孵出[29]。一般注射使用的慢病毒表达载体会携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等标记物便于后期进行阳性动物筛选。

3.5 生物反应器在漫长的生物研究中，人们发现可以利用生物载体自身的代谢和繁殖系统来大量生产需要的蛋白产物，所利用的生物载体被称为“生物反应器”。最初人们利用细菌和细胞作为反应器，但细菌生产的蛋白不具有生物活性，而细胞培养成本较高，使应用受限。随着转基因动物的研究，人们发现动物饲养成本低，并且能产生大量具有活性的目的蛋白，是理想的生物反应器。因此，衍生出乳腺、血液、鸡输卵管等相关生物反应器[30-32]。慢病毒载体以其稳定性、高效率、基因整合的天然优势成为构建生物反应器的首选工具，产生的转基因动物还能够形成稳定的后代遗传性状，具有广阔的应用前景。

4 展望

慢病毒载体系统的出现，推动了疾病研究进展，也加速了优良畜禽的筛选进程，推动了生物技术的发展。但目前慢病毒载体在转染过程中仍存在病毒滴度过低，潜在的生物毒性等缺点，限制了临床应用。如何进行优化，使慢病毒载体更加稳定，更好地与现有试验技术相结合为动物研究服务将是日后关注的重点。