温肺补气通络方对TGF-β1诱导A549细胞增殖及上皮间质转化的影响

丁露 宋思雨 李雅馨 李香艳 王泽玉

(长春中医药大学 1中西医结合学院，吉林 长春 130117；2吉林省人参科学研究院)

肺纤维化是由多种病因引起的累及肺泡、肺间质、细支气管的慢性、弥漫性、间质性肺疾病，患者中位生存期平均3～5年，死亡率较高；目前主要以对症治疗为主〔1，2〕。肺泡上皮细胞在转化生长因子(TGF)-β1诱导下导致细胞过度增殖和上皮间质转化(EMT)〔3〕，并伴有平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)过度表达；上述病理过程在肺纤维化形成中起决定性作用〔4，5〕。基于“久病入络”理论和多年临床实践，在经方补阳还五汤基础上加减化裁为温肺补气通络方(WFBQTL)，多年临床应用已证实该方具有抗炎、止咳、平喘、化痰的作用〔6〕，但对肺泡上皮细胞增殖及间质化的影响尚不清楚。本研究在TGF-β1诱导的肺腺癌A549细胞模型上，探讨WFBQTL对细胞增殖及EMT的作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞 Ⅱ型肺泡上皮细胞来源人非小细胞腺癌A549细胞，来源于中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。

1.2试剂与用药 WFBQTL组成为黄芪、黄芩、丹参、虎杖、当归、川芎、地龙、连翘、紫苑、款冬花、姜半夏，购自长春中医药大学附属医院。胎牛血清(Clark，美国)；RPMI1640培养基(Gibco，美国)；10倍磷酸盐缓冲液(PBS，碧云天)；胰酶、青链霉素双抗(勃林格殷格翰生物药业)；TGF-β1(Sigma，美国)；甲基偶氮唑蓝(MTT)粉末(索莱宝公司)；抗体E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、Collagen Ⅰ、α-SMA、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(Abcam，英国)、TRIzol试剂(Invitrogen，美国)、逆转录试剂盒(天根公司)和PCR引物(上海生工)。

1.3实验仪器 CO2培养箱、酶联免疫检测仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；蛋白电泳仪、转膜仪、荧光实时定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；可视相差倒置显微镜(奥林普斯，日本)、多色荧光、化学发光凝胶成像系统(ProteinSimple，美国)。

1.4温肺补气通络方的制备 将中药饮片用玻璃器皿按1∶10比例煮沸，每次煎煮0.5 h，共煎3次，合并所有煎出的药液；过滤、离心取上清，在80℃条件下加热浓缩，经冷冻干燥机进行冻干处理获得粉末。使用时，称取5 mg干粉溶于1 ml PBS溶液，配置成5 mg/ml母液，过滤除菌后置于4℃保存备用。

1.5细胞培养及分组处理 从液氮中取出冻存的A549细胞，于37℃恒温水浴摇晃溶解至冰水混合状态，在紫外消毒的超净台内，将细胞悬液加入9 ml含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI1640完全培养基中；1 000 r/min离心5 min后弃除上清，再用5 ml RPMI1640完全培养基重悬细胞，加入T25培养瓶中于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。次日进行常规换液，观察细胞生长状态，细胞生长密度至70%使用胰酶消化传代培养扩增。将A549细胞铺于96/6孔板内，用5 ng/ml TGF-β1诱导建立细胞模型，同时给予不同浓度的WFBQTL对其干预，进而观察细胞增殖和EMT相关标志物变化情况，并拍照记录细胞形态。对照组：完全培养基，TGF-β1组：5 ng/ml TGF-β1，WFBQTL：5 ng/ml TGF-β1+WFBQTL(62.5、125.0、250.0、500.0 μg/ml)干预24、48或72 h。

1.6MTT法 3组处理后，每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液继续培养4 h，再加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，震荡30 s混匀，使用酶标仪在波长490 nm下检测各孔吸光度(OD)值，计算各组细胞增殖率。

1.7荧光实时定量PCR(qPCR)检测 收集各组细胞样品加入200 μl TRIzol裂解液，充分吹打至透明提取总RNA，按照逆转录试剂盒操作流程获得cDNA；按如下反应体系：上下游引物各1 μl、去RNA酶水2 μl、样品cDNA 1 μl和SYBR Green MIX 5 μl进行qPCR分析；95℃，5 min；40个PCR循环(95℃，15 s；5℃，30 s)。每个样品3复孔，依据PCR熔解曲线获得Cq值；再根据2-ΔΔCt公式计算目标基因的相对表达量。E-Cadherin：上游序列：CTGATGCTGATGCCCCCAATA，下游序列：CTGCATCTTGCCAGGTCCTT；N-Cadherin：上游序列：ATCAAGCCTGTGGGAATCCG，下游序列：AGCTGTGGGGTCATTGTCAG；Collagen Ⅰ：上游序列：CATGACCGAGACGTGTGGAA，下游序列：GGCAGTTCTTGGTCTCGTCA；α-SMA：上游序列：TAGCACCCAGCACCATGAAG，下游序列：CTGCTGGAAGGTGGACAGAG；GAPDH：上游序列：GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT，下游序列：TCTCCAGGCGGCACGTCAGA。

1.8Western印迹 收集并加入RIPA细胞裂解液到各组细胞样品，4℃超声裂解5次，12 000 r/min离心10 min取上清；按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒，根据蛋白标准曲线，测定上述各组样品蛋白浓度，调整上样质量为每孔30 μg蛋白，上样于丙烯酰胺凝胶(5%浓缩胶/12%分离胶)。再利用电泳缓冲液(pH=8.8) 在80～110 V电压下电泳1.5 h，之后利用转膜缓冲液(pH=6.8)、110 V电压湿法转膜到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜 1.5 h。接着用5% BSA-TBST封闭液室温摇晃1 h，按照蛋白Marker进行剪膜，并按照说明书配制相应浓度的一抗稀释液，4℃摇床过夜；再用TBST溶液清洗5次，5 min/次，加入终浓度1∶5 000的二抗稀释液，室温摇晃1 h，再用TBST溶液清洗5次，5 min/次；最后使用ProteinSimple凝胶成像系统进行发光显色，拍照记录条带。

1.9统计学方法 采用Graphpad Prism9.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1MTT法检测A549细胞增殖存活情况 与对照组相比，TGF-β1组OD值分别在24、48 h时出现升高(均P<0.05)，72 h有少量下降。与TGF-β1组比较，WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml、500.0 μg/ml组抑制TGF-β1诱导的A549细胞增殖并伴有浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，其作用48 h和72 h抑制增殖效果明显，见表1。

2.2倒置显微镜观察A549细胞形态改变 显微镜下可见TGF-β1刺激的A549细胞伪足拉长，细胞核皱缩，细胞密度变大。WFBQTL作用72 h后，A549细胞随着浓度的加大细胞形态逐渐恢复，细胞密度逐渐减小，见图1。

1～6：对照组；TGF-β1组；TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml组；TGF-β1+WFBQTL 125.0 μg/ml组；TGF-β1+WFBQTL 250.0 μg/ml组；TGF-β1+WFBQTL 500.0 μg/ml组图1 显微镜下观察不同分组细胞的形态(×40)

2.3qPCR法检测A549细胞增殖及EMT相关基因的变化 与对照组相比，TGF-β1组降低E-Cadherin基因mRNA水平表达；与TGF-β1组比较，TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml组E-Cadherin表达明显上调(均P<0.05)，呈浓度依赖性。而在TGF-β1诱导下，与对照组相比，TGF-β1组N-Cadherin、Collagen Ⅰ和α-SMA基因表达均明显升高(均P<0.05)；与TGF-β1组比较，TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml组N-Cadherin、Collagen Ⅰ和α-SMA基因表达明显降低(均P<0.05)，其中高剂量组最显著。见表2。

2.4Western印迹法检测A549细胞增殖及EMT相关蛋白的变化与对照组相比，TGF-β1组细胞E-Cadherin蛋白表达明显下降，而N-Cadherin、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与 TGF-β1组比较，TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml组细胞中E-Cadherin蛋白表达明显上升，N-Cadherin和Collagen I蛋白表达逐渐下降(均P<0.05)；对α-SMA的表达有轻度抑制作用，见图2，表3。

图2 Western印迹结果

3 讨 论

研究显示，有很多潜在因子能够激活特发性肝纤维化(IPF)中EMT的发生，在分离培养的气道上皮细胞中，TGF-β1能促进上皮细胞发生EMT〔6〕。TGF-β1是目前公认导致肺纤维化的重要细胞因子，在肺纤维化的形成中起决定性作用〔7，8〕，能促进大量炎症因子的产生并趋化至特定组织，进而影响成纤维细胞的增殖，导致间质化的发生〔9〕。WFBQTL源于吉林省名中医宫晓燕教授治疗肺纤维化临床经验方，本病隶属于“肺痹”范畴，病机关键是毒损肺络，瘀而滞久，从寒、从痰、从瘀，故以温肺通络为治疗大要。本研究发现WFBQTL在处理TGF-β1诱导的A549细胞增殖过程中能够起到明显的抑制作用，在不同时间段采用浓度梯度WFBQTL处理后，细胞的增殖水平出现下调趋势并呈浓度依赖、时间依赖。本研究结果提示WFBQTL可改善EMT过程，通过EMT相关标识物的检测进一步证实上述结论，主要包括E-Cadherin、N-Cadherin、Collagen Ⅰ、α-SMA。

E-Cadherin是一类依赖钙离子而存在的黏附因子，能促使细胞与细胞间形成稳定的黏附带，维持上皮组织稳定。若E-cadherin的表达被抑制，上皮细胞间的接触连结结构会被破坏，进而促进上皮细胞发生EMT，转变为类似具有高度运动潜能的间质细胞〔10，11〕。E-Cadherin的抑制是整个EMT的核心环节〔12〕。本研究结果表明WFBQTL能够对细胞骨架及结构的完整性起到保护作用。N-Cadherin与E-Cadherin同属于经典Ⅰ类钙黏蛋白，被称作“黏附开关”，Lade-Keller等〔13〕研究证实N-Cadherin表达上调与细胞增殖迁移转移呈正相关，N-Cadherin也被作为促进细胞EMT的启动因子〔15〕，本研究结果推测WFBQTL能够抑制细胞的迁移转移功能。Collagen Ⅰ是细胞外基质及间充质的主要组成成分之一，通过调控胶原的迁移起到维持细胞骨架稳定性的作用，研究发现Collagen Ⅰ的积累能够诱发组织及组织间隙的炎症，能够诱导组织纤维化的发生〔16〕，WFBQTL在处理TGF-β1诱导的A549细胞上Collagen Ⅰ蛋白下降，说明WFBQTL通过降低Collagen Ⅰ的表达，调控细胞周围胶原的迁移能力，降低了细胞间质化水平。α-SMA是EMT的主要标志蛋白，存在于干细胞与前体细胞的肌动蛋白中，研究表明几乎所有的成纤维组织及纤维组织表达α-SMA〔17〕，α-SMA在参与机体、细胞纤维化的同时能够调节细胞间质化，是肌成纤维细胞产生的标志〔18〕；经过WFBQTL处理后，在发生EMT的细胞上α-SMA蛋白表达发生下调。

综上，WFBQTL能够下调肺纤维化与增殖相关蛋白N-Cadherin、Collagen Ⅰ、α-SMA的表达，通过回调E-Cadherin蛋白起到保护细胞膜的完整性，修复细胞损伤，抑制细胞发生间质化的作用。