先天性巨结肠症患儿病变结肠组织GAP-43、MEF2表达变化及其意义

任传涛，杨洪超，武靖华，李爱武

1 德州市人民医院，山东德州253000；2 山东大学临床学院；3 山东大学齐鲁医院

先天性巨结肠症（HD）又称肠管无神经节细胞症，是小儿消化道发育畸形中的常见疾病之一［1］。目前，HD 的病因尚不明确，一般认为是由肠神经系统发育缺陷引起的［2］。有研究报道，多种参与肠神经系统分化、发育和突触形成的蛋白在HD 病变结肠组织中表达异常，这些异常表达的蛋白可能在HD 发生、发展中起重要作用，但其具体机制尚不清楚［3］。生长相关蛋白43（GAP-43）是一种存在于神经突触前末端的生长相关蛋白，与神经突触生长、神经系统发育以及神经再生关系密切［4］。肌细胞增强因子2（MEF2）是一种调控肌肉形成和发育的核转录因子，在肌肉组织中广泛表达。近年研究发现，MEF2 在神经系统中亦大量存在，具有调控突触形成和神经元成熟等生物学功能［5］。有研究认为，GAP-43、MEF2异常表达可能与包括HD在内的肠神经系统疾病密切相关［6-7］。但目前国内外关于HD 患儿病变组织GAP-43、MEF2 表达变化的报道较少。为此，本研究观察了HD患儿病变结肠组织GAP-43、MEF2表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018 年1 月—2020 年1 月德州市人民医院收治的HD患儿41例（观察组）。所有患儿符合《新生儿先天性巨结肠的诊断与治疗》［8］中的诊断标准，并经术后组织病理学检查明确诊断。纳入标准：①符合HD 诊断标准；②接受巨结肠切除手术；③术前未接受任何治疗。排除标准：①合并其他消化道畸形者；②非足月患儿。其中，男32例、女9 例，年龄（1.58 ± 0.44）岁。本研究经德州市人民医院医学伦理委员会批准，所有患儿监护人知情同意并签属知情同意书。

1.2 GAP-43、MEF2 mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。取手术切除的结肠组织，液氮速冻后转运至-80 ℃冰箱保存。选取痉挛段无神经节细胞的结肠组织（病变结肠组织）、近端扩张段有神经节细胞的结肠组织（正常结肠组织）各约100 mg，采用TRIzol 法提取组织总RNA，经UV1901 型紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.7～2.0，经琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA 完整，可用于后续实验。分别取总RNA 1 μg，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit 说明将总RNA 反转录为cDNA。反转录条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s。以cDNA 为模板，按SYBR®Premix EX TaqTMⅡ试剂盒说明进行PCR 扩增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：GAP-43 上游引物5"-CTGACCAAGAACATGCCT⁃GA-3"，下游引物5"-GGGACTTCAGAGTGGAGCTG-3"；MEF2 上 游 引 物5"-CCGACTGCCTACAACACT⁃GA-3"，下游引物5"-GATAACTGCCCTCCAGCAAC-3"；β-actin 上 游 引 物5"-AGACCTGTACGCCAACA⁃CAG-3"，下游引物5"-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3"。PCR 反应体系共25 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，无酶水8.5 μL；反应条件：95 ℃变性12 s，55 ℃退火12 s，72 ℃延伸15 s，共45 个循环。以β-actin 为内参，采用2-ΔΔCT法计算GAP-43、MEF2 mRNA 相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 GAP-43、MEF2蛋白表达检测 ①采用Western blotting 法。取病变结肠组织和正常结肠组织各约100 mg，液氮下研磨成粉末，组织裂解液充分裂解，离心提取组织总蛋白。经BCA 法蛋白定量合格后，加入上样缓冲液，100 ℃水浴变性。取变性蛋白约30 μg，SDS-PAGE 分离蛋白。电泳结束，将蛋白电泳产物电转印至PVDF 膜。然后将PVDF 膜用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入GAP-43（稀释比为1∶1 000）、MEF2（稀释比为1∶1 000）、GAPDH（稀释比为1∶2 000）一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP标记的IgG 二抗（稀释比为1∶1 000），室温孵育1 h，ECL发光，暗室中曝光、显影。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。②免疫组化法。取新鲜的病变结肠组织和正常结肠组织，10%中性甲醛固定24 h，常规脱水、透明和石蜡包埋，4 μm 厚连续切片。切片常规脱蜡、水化，微波修复抗原，室温下孵育10 min，分别加入鼠抗人GAP-43、MEF2多克隆抗体，室温孵育过夜。次日，再滴加相应的二抗，室温孵育30 min。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。采用双盲法由两位经验丰富的病理科医师独立阅片，结果不一致时协商统一。GAP-43、MEF2 阳性染色定位于细胞质或细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒状。以染色强度和阳性细胞比例综合评价。染色强度评分标准：无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例评分标准：＜5%为0分，5%～＜25%为1分，25%～＜50%为2 分，50%～＞75%记为3 分，75%以上为4 分。两项评分相加＞2分为阳性表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以±s表示，结果比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Spearman 相关分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病变结肠组织与正常结肠组织GAP-43、MEF2表达比较 见表1。

2.2 病变结肠组织与正常结肠组织免疫组化染色结果 光镜下，病变结肠组织与正常结肠组织黏膜下肌层和肌间神经细胞均可见GAP-43、MEF2 阳性表达，病变结肠组织GAP-43、MEF2 阳性染色较少，而正常结肠组织阳性染色较多，见图1。病变结肠组织与正常结肠组织GAP-43 阳性表达率分别为29.27%（12/41）、73.17%（30/41），MEF2 阳性表达率分别为24.39%（10/41）、63.41%（26/41）。病变结肠组织GAP-43、MEF2 阳性表达率均低于正常结肠组织（P均＜0.05）。

表1 病变结肠组织与正常结肠组织GAP-43、MEF2 mRNA和蛋白相对表达量比较（±s）

表1 病变结肠组织与正常结肠组织GAP-43、MEF2 mRNA和蛋白相对表达量比较（±s）

注：与正常结肠组织比较，*P＜0.05。

组织类型n GAP-43 MEF2病变结肠组织正常结肠组织蛋白0.34±0.09*0.44±0.12 41 41 mRNA 0.70±0.25*0.94±0.33蛋白1.68±0.49*2.24±0.46 mRNA 0.05±0.01*0.13±0.04

图1 病变结肠组织与正常结肠组织GAP-43、MEF2阳性染色情况（免疫组化染色，100×）

2.3 病变结肠组织GAP-43 表达与MEF2 表达的关系 Spearman 相关分析显示，病变结肠组织GAP-43 mRNA 相对表达量与MEF2 mRNA 相对表达量呈正相关关系（r=0.634，P＜0.05），GAP-43蛋白相对表达量与MEF2 蛋白相对表达量亦呈正相关关系（r=0.543，P＜0.05）。

3 讨论

HD 是一种比较常见的先天性肠神经系统发育畸形，在新生儿中的发病率为0.02%～0.05%，并且存在性别差异，男女之比约为4∶1。如果不及时治疗，易在新生儿期并发小肠炎，严重者常常因中毒性休克而死亡［9-10］。HD最基本的病理变化是病变肠段肌肉和黏膜下层神经节细胞缺如。消化道肠管内神经节细胞是由外胚层的神经嵴细胞发育而来，在胚胎期6～12 周，神经嵴细胞沿头尾向消化道壁移行形成神经节，且分化成不同亚型进入肠道神经元。肠道神经元的生存依赖于肠道演化过程中所提供的微环境，当微环境发生改变时，神经嵴细胞移行停顿，神经节生成受限，无神经细胞节段延长［11］。目前，造成肠道神经元发育停顿的机制尚不明确，可能是由多个基因的累加效应引起的［12］。

GAP-43是目前研究较多的一类神经营养因子，在促进神经突触生长、神经系统发育以及神经再生等方面具有重要作用。有研究报道，肠神经系统中GAP-43表达降低时，其传递的肠神经系统抑制性神经递质相应减少，从而引起抑制性神经减弱、兴奋性神经增强，导致肠管收缩增强，从而引起HD［13-14］。此外，肠道蠕动依赖神经细胞与平滑肌细胞的连接，突触则是两者连接的根本结构，而肠神经系统中存在大量的突触，故突触异常也是导致肠道功能障碍的重要因素。毕佳琦等［15］研究发现，上调突触可塑性相关蛋白GAP-43 表达，能够激活PI3K/PTEN/AKT 信号途径，促进大鼠肠道突触修复，由此认为GAP-43低表达可导致抑制性神经递质减少，神经分化受限、突触结构异常，继而导致神经与肠壁的连接受限，神经化学信号传导异常，从而导致HD 的发生。本研究结果发现，病变结肠组织GAP-43 mRNA和蛋白表达均低于正常结肠组织，提示GAP-43低表达能够促进HD的发生、发展。

MEF2 为MDAS-box 转录因子家族中的一种转录调节因子，在脊椎动物中含有4 种亚型：MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。 MEF2 可 通 过 激 活MAPK、PKC 等多条信号通路对细胞增殖和分化进行调节［16］。以往对MEF2 的研究多围绕生肌过程，在骨骼肌、心肌、平滑肌的发育过程中介导细胞的分化。近年研究发现，MEF2 在神经系统发育过程中亦具有重要作用，特别是在中枢神经系统的神经细胞中，MEF2的4种类型均高表达［17］。雷颉等［18］研究发现，MEF2C 在胶质母细胞瘤中高表达，故认为MEF2 可能与神经细胞的功能或分化程度密切相关。本研究结果发现，病变结肠组织MEF2 mRNA和蛋白表达均低于正常结肠组织，提示MEF2 低表达能够促进HD的发生、发展。

GAP-43、MEF2在神经发育过程中均具有重要作用。本研究在HD患儿病变结肠组织中发现GAP-43、MEF2 均阳性表达，并且病变结肠组织GAP-43、MEF2 阳性表达率均低于正常结肠组织。笔者认为GAP-43、MEF2 表达降低可导致神经嵴细胞沿消化道壁移行受阻，从而促进了HD 的发生［19］。Spear⁃man 相关分析显示，病变结肠组织GAP-43 mRNA 和蛋白相对表达量与MEF2 mRNA 和蛋白相对表达量均呈正相关关系，提示GAP-43、MEF2可能共同参与HD的发病过程。

综上所述，HD 患儿病变结肠组织GAP-43、MEF2 低表达，并且二者表达呈正相关关系，二者可能共同参与HD 的发病过程。但由于本研究样本量较小，也没有直接证实GAP-43、MEF2与神经信号传导的关系，故其结论仍需进一步验证。