雷公藤红素对脂多糖诱导脓毒症大鼠ALI的影响及其机制

何招辉，杨春丽，杨小刚，黄翠兰，郭经华

江西省人民医院，南昌330006

急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是导致重症监护病房脓毒症患者死亡的重要原因［1］。研究表明，脓毒症早期即存在严重的全身炎症反应，大量炎症因子可使肺微血管内皮细胞屏障功能失衡，血管通透性增加，导致弥漫性肺间质水肿和肺泡水肿［2］。因此，炎症反应是脓毒症ALI/ARDS 发生、发展的关键环节。目前，对于脓毒症ALI/ARDS 仍无特效治疗方法，抑制早期剧烈的炎症反应可能是一个值得探索的研究方向。雷公藤红素是从传统中药雷公藤根部提取的一种醌甲基三萜类化合物，具有多种药理活性，如抗炎、抗肿瘤、免疫调节等。有研究报道，雷公藤红素可通过调节炎症信号通路、抑制炎症因子产生和调节免疫细胞活性等发挥抗炎和免疫调节作用，对多种自身免疫性疾病和炎症反应性疾病具有治疗作用［3］。但目前鲜见雷公藤红素治疗脓毒症相关ALI的报道。2018年1 月—2020 年12 月，本研究观察了雷公藤红素对脂多糖（LPS）诱导脓毒症大鼠ALI的影响，并探讨其作用机制，旨在为药物治疗脓毒症相关ALI 提供新的思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD 大鼠18 只，6～8 周龄，体质量300～450 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（湘）2019-0014。所有大鼠于独立通风笼具内单笼饲养，饲养环境温度24～26 ℃、相对湿度40%～60%，光照12 h 明暗交替，自由摄食和饮水。

雷公藤红素，纯度＞99%，CAS 号34157-83-0，购自武汉易泰科技有限公司上海分公司。LPS，购自美国Sigma 公司。GEM3500 血气分析仪，购自美国IL 公司。DM2500P 偏光显微镜，购自美国LEICA 公司。HED-SY96S 酶标仪，购自山东霍尔德电子科技有限公司。大鼠TNF-α、IL-1β、细胞间黏附分子1（ICMA-1）、血管内皮细胞黏附分子1（VCAM-1）、核因子κB（NF-κB）ELISA试剂盒，购自江苏绿叶生物科技有限公司。胞浆胞核蛋白提取试剂盒，购自美国Sigma公司。

1.2 动物分组处理 所有大鼠适应性喂养3 d，按随机数字表法随机分为对照组、模型组、雷公藤红素组，每组6 只。模型组和雷公藤红素组经尾静脉一次性注射LPS 5 mg/kg建立ALI模型。雷公藤红素组同时经腹腔单次注射0.02%雷公藤红素1 mg/kg，模型组同时经腹腔注射等量生理盐水，对照组分别经尾静脉和腹腔注射等量生理盐水。注射完毕，常规饲养24 h。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准，并经江西省人民医院动物伦理委员会审批（审批号：2019127）。

1.3 观察指标

1.3.1 腹主动脉血氧分压（PO2） 各组注射完毕，常规饲养24 h，经腹主动脉取血1 mL，采用GEM3500血气分析仪检测腹主动脉血PO2。

1.3.2 肺组织湿重干重比值（W/D） 腹主动脉取血后，腹腔注射20%乌拉坦过量麻醉致死，无菌条件下解剖胸腔，取左肺组织，用电子天平称湿重（W），然后置于60 ℃烘箱烘干至恒重，再用电子天平称干重（D），计算肺组织W/D。

1.3.3 肺组织病理观察与肺损伤病理评分 取右肺下叶组织，置于4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，4 μm 厚连续切片，二甲苯脱蜡后，再经高浓度乙醇到低浓度乙醇，直至蒸馏水，最后HE 染色。光镜下观察肺组织病理改变，并行肺损伤病理评分。采用4项指标评估肺损伤程度：①肺泡充血；②肺泡出血；③肺泡间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；④肺泡间隔增厚和（或）透明膜形成。评分标准：无损伤记0分，轻度损伤记1分，中度损伤记2分，重度损伤记3分。各项评分的总和即为肺损伤病理评分［4］。

1.3.4 肺组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 含量 取右肺中上叶组织，置于组织匀浆器中，冰浴下匀浆，然后3 000 r/min离心10 min、离心半径13.5 cm，留取上清液。采用ELISA 法检测肺组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 含量。所有操作严格按照试剂盒说明进行。

1.3.5 细胞核和细胞质内NF-κB 含量 取右肺下叶组织，RIPA 裂解液充分裂解，按胞浆胞核蛋白抽提试剂盒说明提取细胞质蛋白和细胞核蛋白。采用ELISA法检测细胞核和细胞质内NF-κB含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey"s 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组腹主动脉血PO2、肺组织W/D、肺损伤情况比较 三组腹主动脉血PO2、肺组织W/D、肺损伤病理评分比较见表1。对照组镜下可见肺泡结构清晰，肺泡壁光滑，肺泡内无液体和炎症细胞浸润。与对照组比较，模型组肺泡充血和出血明显，并伴有大量炎症细胞浸润，肺泡结构塌陷，轮廓不清。与模型组比较，雷公藤红素组肺泡充血和出血明显减轻，肺泡可见少量炎症细胞浸润，肺泡结构清晰可见。见图1。

表1 各组腹主动脉血PO2、肺组织W/D、肺损伤病理评分比较（±s）

表1 各组腹主动脉血PO2、肺组织W/D、肺损伤病理评分比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别对照组模型组雷公藤红素肺损伤病理评分（分）0.67±0.21 12.50±0.43*5.50±0.43*#n6 6 6腹主动脉血PO2（mmHg）99.17±5.83 61.67±2.77*72.00±2.44*#肺组织W/D 2.83±0.04 4.65±0.08*3.46±0.03*#

图1 三组肺组织病理学变化（HE染色，40×）

2.2 三组肺组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB含量比较 见表2。

表2 三组肺组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB含量比较（ng/L，±s）

表2 三组肺组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB含量比较（ng/L，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别对照组观察组雷公藤红素n6 6 6 TNF-α 24.50±1.89 281.20±5.38*139.50±6.33*#IL-1β 1.65±0.13 29.00±2.48*12.67±0.92*#ICAM-1 6.38±0.29 175.80±6.44*93.00±4.09*#VCAM-1 12.50±1.38 154.00±7.10*81.17±4.17*#NF-κB细胞核内400.00±10.41 702.20±15.64*536.20±10.23*#细胞质内404.70± 9.62 213.30± 9.14*346.80±13.77*#

3 讨论

ALI/ARDS 是导致重症监护病房脓毒症患者死亡的重要原因［1］，其特征是失控的炎症反应和肺泡上皮屏障、肺微血管内皮屏障损伤，导致肺泡毛细血管通透性增加，炎症细胞浸润，细胞因子和趋化因子大量释放，继而引起急性非心源性肺水肿［5-6］。因此，炎症反应是ALI/ARDS 的本质。目前，脓毒症ALI/ARDS 仍无特效治疗方法，只能以肺保护性通气策略、限制性液体复苏等对症支持治疗［7］，而抑制早期剧烈的炎症反应可能是一个值得探索的研究方向。

雷公藤红素是从传统中药雷公藤根部提取的一种醌甲基三萜类化合物，因其具有高效低毒的抗肿瘤作用，最早在临床上被广泛用于肿瘤治疗。后来研究发现，雷公藤红素还具有抗炎、抗氧化、免疫调节等药理活性［8］。在动物试验中发现，雷公藤红素能够减轻小鼠气道炎症反应和ALI。如刘瑞麟等［9］研究认为，雷公藤红素可通过调节成纤维细胞产生肺组织干细胞因子，抑制肥大细胞产生组胺和嗜酸性粒细胞趋化因子，从而减轻哮喘小鼠气道炎症反应；王君涛等［10］经腹腔注射雷公藤红素发现，小鼠盐酸吸入性肺损伤明显减轻。雷公藤红素还可抑制炎症因子引起的黏附分子表达以及对白细胞的黏附。低剂量雷公藤红素能增加细胞间连接分子表达并抑制黏附分子表达，抑制内皮细胞黏附白细胞能力，具有抗炎症反应作用［11］。雷公藤红素能够通过抑制NF-κB 信号通路抑制LPS 诱导的促炎症细胞因子IL-6、IL-8、MCP-1 蛋白和mRNA 表达［12］。此外，雷公藤红素还可通过抑制NF-κB 活化和TNF-α、IL-1β 表达，减轻炎症反应，从而减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤［13］。由此推测，雷公藤红素可能通过抑制NF-κB信号通路，发挥抑制炎症反应的作用。

本研究结果发现，雷公藤红素组腹主动脉血PO2较模型组明显升高，肺组织W/D 较模型组明显降低，表明雷公藤红素可减轻大鼠ALI 时肺泡液体渗出，从而改善组织氧合。与模型组比较，雷公藤红素组肺组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 含量明显下降，肺组织细胞质和细胞核内NF-κB 含量均明显升高。NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的多向性转录因子，可参与人体的多种生物学过程，能够调节多种细胞因子、黏附分子、趋化因子等基因表达［14］。NF-κB蛋白通常以同源或异源复合物的形式存在。细胞在静息状态下，细胞质中的p50/p65 与其抑制物IκB 结合形成三聚体，使其不能核易位。当细胞受到外源性信号刺激时，IκBα 被磷酸化后降解，而被释放的p50/p65 则进行核易位，与基因上的IκB 位点特异性结合，发挥调节细胞功能的作用［15］。本研究发现，雷公藤红素能够抑制NF-κB 向核内转位，同时发现TNF-α、IL-β、ICAM-1、VCAM-1 等炎症因子分泌减少。因此推测，雷公藤红素能够抑制脓毒症大鼠体内的炎症反应，其作用机制可能是通过抑制NF-κB的核内转位实现的。

综上所述，雷公藤红素能够抑制LPS 诱导的脓毒症大鼠ALI，其机制可能与抑制NF-κB 的核内转位，从而抑制大鼠体内炎症因子的含量有关。这为临床治疗脓毒症ALI/ARDS提供了新的思路。