一种中西药复配消毒抑菌剂的消毒抑菌效果、毒性和稳定性

张雨凝, 张蕊, 杨镇伟, 杜鑫, 王立强

(1. 华侨大学 医学院， 福建 泉州 362021；2. 深圳联创立达环境技术有限公司， 广东 深圳 518116)

杀菌消毒是预防病毒传播流行的一项非常重要的措施.目前普遍使用的消毒产品主要有含氯消毒剂、醇类消毒剂、含碘消毒剂和过氧化物类消毒剂几大类[1].但是，高浓度含氯消毒剂具有腐蚀性和刺激性，会对人体和生态环境造成危害；醇类消毒剂(乙醇、异丙醇等)由于其较强的氧化、脂溶作用，长期用于手和皮肤消毒后，易使人们产生过敏性皮炎、失水、干裂痛感；过氧化物类消毒剂(过氧乙酸、双氧水等)虽然杀灭效果好，但其性质不稳定，容易分解，在运输和储存的过程中易发生爆炸.随着人们消毒预防意识的提高，研制一种安全、高效、环保的消毒剂成为当务之急.

近年来，中药消毒剂在消毒学领域取得新进展，将中药应用于消毒剂不仅开辟了中药药源，还扩大了中药的使用范围.中药消毒剂取材天然，安全无毒，气味芳香.某些中药成分具有多靶点及显著的体外抗病毒、抗菌效果，可有效抑制病源复制、阻断病源传播[2]，具有广泛的应用价值，并由于组方中的多元成分协同作用，不易产生耐药性.复方季铵盐类消毒剂具有毒性低、抑菌温和、抑菌谱广的特点[3]，但也存在不足，如毒性蓄积、对部分微生物杀灭效果不理想等，在一定程度上限制了此类消毒剂的应用.为获得广谱、安全、高效的消毒剂，中西药复配消毒剂已成为新的研究热点.有研究表明，将中药提取液与季铵盐类消毒剂复配[4-5]，既可弥补单一使用中药消毒剂起效慢、杀灭效率低的不足，又可降低单用季铵盐消毒剂的腐蚀性、难降解性和不良反应率，从而实现减毒增效且环保的完美效果.基于此，本文研究一种以复方中药提取物为主、季铵盐类衍生复合物为辅的复配消毒抑菌剂的消毒抑菌效果、毒性和稳定性.

1 材料与方法

1.1 试验材料

复配消毒抑菌剂为以中药提取物(大黄、姜黄、苦参、金银花、藿香、黄柏和艾叶等)和季铵盐类衍生复合物(二甲基苄基氯化铵、十八烷基二甲基氯化铵和二癸基甲基聚丙酸铵)为主要成分的黄色澄明液体，无刺激性气味，pH值为8.12，由国内某公司提供.

试验病毒H9N2亚型禽流感病毒、HCoV-NL63病毒和试验菌金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(ATCC 8099)、白色念珠菌(ATCC 6538)均由军事医学科学院消毒检测中心提供.

试验动物为SPF级小鼠和普通级家兔，购自福建医科大学实验动物中心，许可证号为SCXK(闽)2016-0002.

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液与病毒悬液的制备 试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌，试验病毒为H9N2亚型禽流感病毒和HCoV-NL63病毒.依据卫生部发布的《消毒技术规范(2002年版)》(下同)[6]规定的相应方法，制备试验菌悬液和病毒悬液备用.

1.2.2 中和剂鉴定试验 试验菌为金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，试验病毒为H9N2亚型禽流感病毒和HCoV-NL63病毒.依据《消毒技术规范(2002年版)》[6]规定的相应方法，进行中和剂鉴定试验，试验重复3次.

1.2.3 悬液定量杀菌试验 试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌.取含有0.5 mL有机干扰物(体积分数为3%的牛血清白蛋白)的1 mL菌悬液，加入4 mL不同浓度消毒剂的无菌试管中，在20 ℃水浴条件下作用至规定时间，分别在多个装有4.5 mL中和剂的试管中加入制好的0.5 mL样品溶液，混匀并作用10 min，取0.2 mL制好的溶液进行培养计数，计算杀灭对数值，试验重复3次.

1.2.4 病毒悬液定量试验 试验病毒为H9N2亚型禽流感病毒和HCoV-NL63病毒.将0.1 mL有机干扰物质(体积分数为3%的牛血清白蛋白)与0.1 mL病毒悬液混合，并在(20±1) ℃水浴中作用5 min，加入0.8 mL不同浓度的待测消毒剂，混匀后作用至规定时间后，分别取出0.1 mL溶液，通过稀释法去除残留消毒剂，按终点稀释法进行病毒滴度测定并计算病毒滴度，用半数细胞感染剂量(TCID50)表示，并计算灭活对数值，试验重复3次.

1.2.5 动物毒性试验 1) 选取雌性、雄性各10只的KM小鼠，体质量为18～22 g.依据《消毒技术规范(2002年版)》[6]规定的相应方法，设定5 000 mg·kg-1体质量为一个剂量组.按每10 g体质量的小鼠灌胃0.2 mL的剂量，试验组灌复配消毒抑菌剂原液，对照组灌蒸馏水,每组雌、雄各半.连续观察小鼠14 d，记录它们的中毒与死亡情况.2) 选取3只体质量为2～3 kg的健康大白兔，在试验前24 h，用脱毛剂将大白兔背部脊柱左、右两侧的毛各去掉约3 cm×3 cm的范围.次日，将复配消毒抑菌剂原液涂在一侧皮肤上，另一侧涂蒸馏水作为对照，在涂抹后4 h，用蒸馏水清洗，除去残留物.每天涂抹1次，连续涂抹14 d.在每次涂抹后24 h观察结果，按照《消毒技术规范(2002年版)》[6]的评分标准进行评分和判定受试物对完整皮肤的刺激强度.

1.2.6 稳定性试验 1) 将消毒抑菌剂分成3组，分别置于棕色广口瓶中，在-20,-10,-5,0,5 ℃的环境中放置7 d，观察不同低温下各组消毒抑菌剂的性状.2) 取包装好的消毒抑菌剂样品，依据《消毒技术规范(2002年版)》[6]规定的相应方法，将其置于37 ℃的恒温培养箱中(相对湿度>75%)存放90 d后，检测消毒抑菌剂原液对金黄色葡萄球菌与白色念珠菌的杀菌效果，试验重复3次.

2 试验结果

2.1 中和剂鉴定试验

复配消毒抑菌剂中和鉴定结果,如表1所示.表1中：lg TCID50为平均杀灭对数值.由表1可知：用含质量分数分别为0.5%的硫代硫酸钠、1%的卵磷脂、1%的吐温-80的磷酸盐缓冲液(PBS)作为该复配消毒抑菌剂中和剂，可将消毒剂对试验菌和试验病毒的残留作用有效中和.中和剂与中和产物对试验菌、病毒、细胞株生长没有明显的抑制作用，符合《消毒技术规范(2002年版)》的要求.

表1 复配消毒抑菌剂中和鉴定结果Tab.1 Neutralization identification results of compound disinfectant and bacteriostatic agent

2.2 悬液定量杀菌试验

不同作用时间下,复配消毒抑菌剂对不同试验菌的杀灭对数值,如表2所示.表2中：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的阳性对照组的平均菌数对数值分别为7.52，7.55，6.37.

表2 不同作用时间下复配消毒抑菌剂对不同试验菌的平均杀灭对数值Tab.2 Average killing logarithm value of the compound disinfectant and bacteriostatic agent to different test bacteria under different action times

由表2可知：当使用稀释2倍的该复配消毒抑菌剂对菌悬液作用2 min及以上或使用该复配消毒抑菌剂原液作用1 min及以上时，悬液内的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的平均杀灭对数值均大于5，悬液内的白色念珠菌的平均杀灭对数值均大于4，表明使用该复配消毒抑菌剂原液作用1 min即可将这3种病菌完全杀灭.

2.3 病毒悬液定量试验

不同作用时间下，复配消毒抑菌剂对HCoV-NL63病毒和H9N2亚型禽流感病毒的平均灭活对数值,如表3所示.表3中：HCoV-NL63病毒和H9N2亚型禽流感病毒的阳性对照组平均灭活对数值分别为6.32，5.83.

表3 不同作用时间下复配消毒抑菌剂对HCoV-NL63病毒和H9N2亚型禽流感病毒的平均灭活对数值Tab.3 Average inactivation logarithm value of HCoV-NL63 virus and H9N2 subtype avian influenza virus with the compound disinfectant antibacterial agent under different action times

由表3可知：当复配消毒抑菌剂原液对病毒悬液作用2 min及以上时，HCoV-NL63病毒和H9N2亚型禽流感病毒的平均灭活对数值均大于5，表明使用该消毒剂原液作用2 min及以上即可将这两种病毒完全灭活.

2.4 动物毒性试验

急性经口毒性试验结果表明，对20只小鼠按10 g体质量分别灌胃0.2 mL剂量的复配消毒抑菌剂(受试组)和蒸馏水(正常对照组)，每组各10只,观察14 d后，受试小鼠无死亡，经口半数致死量(LD50)均大于5 000 mg·kg-1.处死小鼠后，解剖尸体，并对组织器官进行观察，正常对照组和受试组小鼠的肝、肾、肠组织的病理学特征，如图1～3所示.由图1～3可知:小鼠的肝、肾、肠组织内均未发现病理改变，表明该复配消毒抑菌剂属于实际无毒[6].

(a) 正常对照组 (b) 受试组 图1 小鼠的肝组织病理学特征Fig.1 Histopathological features of liver in mice

(a) 正常对照组 (b) 受试组 图2 小鼠肾组织病理学特征Fig.2 Histopathological features of kidney in mice

(a) 正常对照组 (b) 受试组 图3 小鼠肠组织病理学特征Fig.3 Histopathological features of intestine in mice

3只健康大白兔多次皮肤刺激试验均未出现皮肤红斑、水肿现象，判断该复配消毒抑菌剂对大白兔的皮肤刺激反应平均指数为0，刺激强度均属无刺激性.

2.5 稳定性试验

复配消毒抑菌剂的低温抗冻性和稳定性试验结果，如表4，5所示.表5中：t为存放时间.由表4,5可知：在不同低温下放置7 d后，该配消毒抑菌剂性状仍保持澄清透明；在37 ℃放置90 d后，用复配消毒抑菌剂原液对金黄色葡萄球菌作用1 min的平均杀灭对数值大于5，对白色念珠菌作用1 min的平均杀灭对数值大于4，表明该复配消毒抑菌剂的低温抗冻性及稳定性较好，可持续有效作用2 a[6].

表4 复配消毒抑菌剂的低温抗冻性试验结果Tab.4 Test results of low temperature frost resistance of compound disinfectant and bacteriostatic agent

表5 复配消毒抑菌剂的稳定性试验结果Tab.5 Stability test results of compound disinfectant and bacteriostatic agent

3 讨论

近年来的研究发现，大黄[7-8]、姜黄[9-10]、苦参[11-13]、黄柏[14-15]、金银花[16-18]、艾叶[19-21]、藿香[22-25]等中药提取物对肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌等多种病菌都表现出较好的抗菌活性，且都具有广谱抗病毒活性，可达到杀灭病毒而不影响宿主细胞的目的，其不仅是治疗病毒性疾病的理想药物，还是环保的体外消毒药物.将中药用于消毒剂的研发，开拓了中药药源，扩大了中药的使用范围，降低了使用传统消毒剂对环境带来的污染和对人体产生的毒副作用，是消毒剂发展的新趋势.有研究表明，将中药与季铵盐类消毒剂配伍可提高消毒剂的消毒效果与稳定性, 且中药残渣对中药季铵盐复合消毒剂的杀菌效果无明显影响[26].

季铵盐类表面活性剂发展至今已衍生了七代产品[27]，其消毒机理为提高细胞膜通透性，使胞质外漏，或者使蛋白酶变性，对细菌繁殖体的杀灭效果好[28].同时，它还能特异性杀灭冠状病毒，这可能与其可破坏冠状病毒外层的生物膜结构有关[29].有研究表明，传统与新型季铵盐及其他杀菌剂的复配可协同杀菌、持续杀菌，提高杀菌效果，降低腐蚀性[30].因此，复配消毒抑菌剂中的季铵盐衍生复合物可达到杀灭微生物与冠状病毒的目的.

GB 26369-2010《季铵盐类消毒剂卫生标准》中对季铵盐消毒剂限定了有效成分季铵盐的使用含量，规定用于手与皮肤的消毒剂不得超过5 000 mg·L-1, 用于黏膜的消毒剂不得超过2 000 mg·L-1[31].但是市售的季铵盐消毒剂为了使其消毒效果达到最佳，往往会提高季铵盐的含量，这不仅会局限消毒剂的应用范围，还会加重对人体的刺激性.文中所用的复配消毒抑菌剂以复方中药提取物为主要成分，加入少量季铵盐衍生复合物(质量分数少于0.1%)，规避了市面上季铵盐使用含量过多而造成对人体皮肤和呼吸道刺激严重的问题，扩大了使用范围，安全环保、消杀迅速、温和持久.

试验结果显示，该消毒抑菌剂原液对悬液内金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、HCoV-NL63病毒和H9N2亚型禽流感病毒均有较好的消杀效果.试验结果发现，该消毒抑菌剂对革兰氏阳性菌的杀灭效果优于革兰氏阴性菌和真菌，且稀释倍数越大，对病菌的杀灭效果越差，作用时间越长，杀灭效果越好，这可能与季铵盐衍生复合物的杀菌机理有关.其次，该消毒抑菌剂对病菌的杀灭效果优于对病毒的灭活效果，原因可能与中药的作用有关，中药虽然具有多靶点，但是其抗病毒的效果较化学药缓慢、持久、温和，需要用高浓度中药消毒剂才能达到有效灭活病毒的效果.因此，使用本研究的复配消毒抑菌剂进行消毒时，建议使用原液进行消毒或适当延长消毒时间以达到预期的消毒效果.

研究所用复配消毒抑菌剂对细菌繁殖体和真菌及试验病毒(包括冠状病毒)表现出较强的消杀效果，但是对于能否针对性地杀灭COVID-19，还有待进一步的研究.试验结果表明，该消毒抑菌剂质量稳定，可在相对寒冷地区使用，杀灭效果持久，有效期可达2 a.然而，光照和氧是否会对消毒抑菌剂的消毒效果产生影响还有待考察.毒性试验结果显示，该消毒抑菌剂未发现急性经口毒性，属实际无毒类，对皮肤无刺激，可用于人体皮肤及粘膜的消毒.研究未对单用中药提取物和季铵盐衍生复合物的消毒效果进行试验，无法判断两者的消毒效果是否具有协同作用，因此，还应对其做进一步的研究.