玉屏风散对肺气虚型变应性鼻炎转录因子T-bet／GATA-3表达的影响

陈 宇，张国庆，曾屹生，许亚桦，蒋双堤

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州350003）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称过敏性鼻炎，主要是已致敏患者再次接触过敏原后，由IgE介导的鼻黏膜超敏反应性疾病，可分为常年性和季节性两大类，发病率高，且难以根除［1-3］。据不完全统计，AR在全球范围内患病人数超过5亿，是目前临床上耳鼻咽喉科常见病之一。基于以往的研究表明，玉屏风散对肺气虚型变应性鼻炎有一定的疗效，但其内在的分子机制仍未有深入的研究，故笔者通过观察玉屏风散对肺气虚型变应性鼻炎大鼠IFNγ与IL-4的浓度及GATA-3、T-bet mRNA表达的影响，试图为益气固表法治疗变应性鼻炎提供基因分子水平的依据。

1 实验材料

1.1 实验动物8周龄SD大鼠，雄性，体质量300 g左右，SPF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 实验试剂 Ⅴ级卵清蛋白、Even Blue（美国Sigma公司，批号：SLBN6684V、MKBQ3656V）；Ⅱ级卵白蛋白、Scott蓝化液、大鼠外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司，批号：912E051、G1865、P8630）；生理盐水（福州辰星药业有限公司，批号：1708262705）；氢氧化铝（广东西陇化工有限公司，1710270）；艾条（南阳香艾有限公司）；升华硫（天津大茂试剂）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批号：171110）；Trizon Reagent，Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒，CW0581M；HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒UltraSYBR Mixture：CWBIO CW0957M（康为世纪生物科技股份有限公司）；Rat IL-4、Rat IFN-γELISA检测试剂盒（武汉酶免生物科技有限公司，批号：MM-0191R2、MM-0198R2）；苏木素染液、伊红染色液（武汉博士德生物有限公司，批号：AR11800-1、AR11800-2）。

1.3 实验仪器Neofuge13R台式冷冻离心机、HFSafe-1800生物安全柜（美国HeaL Force公司）；T100TM PCR仪（美国Bio-Rad公司）；TU-100C干式恒温仪（上海一恒科技）；IX51荧光显微镜、CKX31显微镜（日本Olympus公司）；CFX ConnectTM荧光PCR仪（上海伯乐）；2xGoLdStar Taq MasterMix实时定量PCR仪（康为世纪生物科技股份有限公司）；-80℃冰箱（山东博科）；XH-C旋涡混合器（常州越新）；干式电加热器（海门市其林贝尔仪器）；RT-6100酶标仪（美国Rayto公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 动物实验共分为4组：对照组、AR组、AR＋肺气虚组、AR＋肺气虚治疗组。AR组以0.3 mg卵清蛋白做抗原，30 mg氢氧化铝作为佐剂，加1 mL生理盐水形成混悬液，腹腔注射，隔日1次，共7次，为基础致敏，再以0.25 mg／mL的卵清蛋白的生理盐水2 mL超声雾化吸入，每日1次，连续3 d，为强化致敏。雾化吸入完后的第2天，行被动皮肤过敏（PCA）试验确定OVIgE抗体效价升高后，用5%卵白蛋白的生理盐水喷滴双鼻腔，每侧0.5 mL，每日1次，共7次。AR＋肺气虚组按AR组方法致敏后再建立肺气虚证模型：备好特制玻璃烟熏造模箱（体积60 cm×40 cm×40 cm），特制烟熏艾条（长120 mm，内含7 g硫磺粉、30 g艾绒），将致敏后的大鼠放入烟熏箱，点燃艾条，烟熏30 min，每天2次，连续熏烟15 d。AR＋肺气虚治疗组在AR＋肺气虚组基础上按4 g／（kg·d）给予玉屏风散水煎剂灌胃，上、下午各1次，连续干预7 d。对照组注射等量的生理盐水。

2.2 ELISA法检测IFN-γ与IL-4表达 将试剂盒中所有试剂和组分取出恢复到室温，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL。每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外，用封板膜封板后置37℃温育60 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干洗涤，拍干。每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。每孔加终止液50μL，终止反应，450 nm波长测量各孔的OD值。

2.3 QRT-PCR法检测T-bet、GATA-3 mRNA表达

将组织样品用研钵在液氮下研磨至粉末状，加入对应量的TRlzon Reagent，提取总RNA，防止降解。引物序列T-bet F：CCTGGGGTCGTCCTATTCT，R：TCCGTCCTTGCTTAGTGATG；GATA-3 F：AGCCC ACCACCCCATTA，R：GGTTCTGCCCATTCATTTTA；GAPDHF：GCAAGTTCAACGGCACAG，R：CGCCAGT AGACTCCACGAC。反应体系：RNase Free d H2O 9.5μL，cDNA／DNA 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2xULtraSYBR Mixture 12.5μL。反应条件：预变性95℃10 min，变性95℃10 s，退火56℃30 s，延伸72℃30 s，行40次循环。

2.4 HE染色观察 取出组织流水冲洗数小时，经70%、80%、90%乙醇脱水3 min，无水乙醇、二甲苯混合液（等比例混合）浸泡15 min，二甲苯浸泡至透明为止。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50～60 min。石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返蓝液返蓝15 s，流水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，中性树脂封片，镜检。

2.5 统计学方法 所有数据均采用SPSS 19.0软件进行处理。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组间比较采用多因素方差分析。

3 结 果

3.1 PCA实验 如图1所示，被动致敏后按1 mL／100 g体质量静脉注射0.2%卵清蛋白（以0.5%伊文思兰配制）进行激发，测量皮肤内层的蓝斑大小。直径大于5 mm的蓝斑为阳性，如不规则将长轴与短轴长度的平均值作为直径。可以看到蓝斑很明显，说明致敏成功。

图1 PCA验证实验

3.2 HE染色 对照组鼻窦黏膜假复层纤毛上皮结构完整，排列整齐，黏膜下层无明显炎性细胞浸润；AR组呈慢性炎症表现，黏膜上皮排列紊乱，部分区域坏死脱落；AR＋肺气虚组呈严重的炎症表现，黏膜上皮排列紊乱，许多区域坏死，脱落，炎症程度重于AR组；AR＋肺气虚治疗组黏膜上皮细胞修复较好，炎症程度轻于AR组和AR＋气虚组。见图2。

3.3 4组IFN-γ、IL-4表达比较 见图3。

3.4 4组GATA-3、T-Bet mRNA表达比较 见图4。

4 讨 论

玉屏风散是由黄芪、白术、防风组成的中医经典方剂，它出自元代名医危亦林的《世医得效方》，其因具益气固表之功，临床多用于治疗肺气虚型变应性鼻炎。对于玉屏风散一直有“玉屏组合少而精，芪术防风鼎足行”的说法，方中黄芪益气固表为君；白术补气健脾为臣；佐以防风走表而散风邪，合黄芪、白术以益气祛邪。且黄芪得防风，固表而不致留邪；防风得黄芪，祛邪而不伤正，有补中寓疏，散中寓补之意。三药合用共奏益气固表、扶正祛邪之功。许多现代药理学研究亦表明玉屏风散能够增强机体免疫。洪敏等［4］发现玉屏风散不同提取物能够抑制IFN-γ、促进IL-4分泌，从而影响Th1／Th2细胞因子水平；许洲斌［5］研究发现在免疫状态下，玉屏风散有利于转录因子T-bet和GATA3的表达，从而增强Th1／Th2细胞亚群的分化，保证了机体细胞免疫和体液免疫的正常水平。

本研究通过建立AR动物模型，以卵清蛋白为抗原，腹腔注射致敏2周、超声雾化强化致敏3 d，建立AR模型。利用PCA反应，伊文思兰显色，测定皮肤内层蓝斑直径大于5 mm说明AR模型造模成功。在此基础上再用特制艾条熏蒸的方法建立肺气虚AR模型。最后通过对各组鼻黏膜HE染色观察其组织结构变化，结果显示AR组及AR＋肺气虚组炎症表现明显，黏膜上皮细胞破坏严重，经玉屏风散治疗后炎症程度减轻，黏膜上皮细胞修复良好。

图2 4组大鼠鼻黏膜组织HE染色图（×400）

图3 4组IFN-γ、IL-4表达比较

图4 4组GATA-3、T-bet mRNA表达比较

变应性鼻炎是体外环境因素作用于机体导致异常免疫反应，产生以鼻腔黏膜Th2免疫反应为主的变应性炎症反应［6］。IL-4主要由Th2细胞分泌，与IgE合成、嗜酸细胞的浸润和激活密切相关，参与炎症的发生和发展［7］。本研究结果显示，AR组和AR＋肺气虚组IL-4浓度较对照组明显升高，经玉屏风散治疗后明显降低，提示玉屏风散能够通过抑制IL-4对肺气虚型变应性鼻炎产生治疗作用。

近几年大量研究表明，GATA-3能促使Th0细胞向Th2细胞分化，促进Th2型细胞因子的释放，是Th2细胞的标记分子［8］。T-bet是一种Th1及INF-γ特异性的转录因子，不仅能促使IFN-γ产生，而且能将Th2细胞逆转为Th1［9］。本研究结果显示，经玉屏风散治疗后转录因子T-bet表达明显增高，而GATA-3表达明显降低，表现为抑制Th0细胞向Th2细胞分化，促进其向Th1分化，纠正了Th1、Th2细胞因子表达的免疫失衡，从而对肺气虚型变应性鼻炎起到治疗效果。

综上所述，变应性鼻炎表现为GATA-3表达增强，T-bet表达下降，从而导致Th1细胞分化严重受阻，使机体处于以Th2为优势免疫应答的变态炎症反应，从而引起变应性鼻炎。玉屏风散应用非常广泛，具有多重功效，对呼吸系统、泌尿系统、消化系统等均有不同程度的疗效，究其原因，可能与其治疗作用主要体现在对免疫功能的调节方面，其药理作用研究也主要集中在对机体免疫功能的影响方面［9］。玉屏风散通过抑制GATA-3，上调T-bet，纠正了Th1、Th2细胞的免疫失衡状态，从而起到治疗作用。