HPLC法测定芸香中4个成分的含量①

王亚丽，闫顺华，沙拉麦提·艾力

（新疆维吾尔自治区药品检验研究院；国家药品监督管理局中药（维药）质量控制重点实验室，乌鲁木齐830054）

芸香为芸香科芸香属植物（Ruta graveolens L.）的干燥地上部分，主要含挥发油、脂肪油、黄酮类、生物碱、香豆素类等成分，具有清热解毒，凉血散瘀等功效，临床上用于治感冒发热、风火牙痛、头痛，跌打扭伤[1]。临床研究表明，生物碱类成分是芸香镇痛、解痉和镇静的重要药用物质基础，其中芸香碱、茵芋碱和白鲜碱均具有镇痛、解痉和镇静作用。花椒毒素属呋喃香豆素类天然化合物，有抗实验性心律失常、镇痛、抗炎、松弛大鼠子宫、家兔回肠和血管平滑肌、抑制豚鼠心脏等作用[4-8]。本实验采用高效液相色谱法同时测定芸香中芸香碱、花椒毒素、茵芋碱和白鲜碱等4个成分的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），XS205DU型电子天平（梅特勒-特伦多公司）。

1.2 试药 芸香碱（Adooq Bioscoence公司，L13917B001）；茵芋碱（麦克林公司，C10650228）；花椒毒素（Bepure公司，190521004，）；白鲜碱（中国食品药品检定研究院，111654-200602）；乙腈（色谱级，Fisher公司）；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

1.3 药材 实验用药材20190701（S1）、20190922（S2）、20190821（S3）、20190722（S4）、20190915（S5）、20190801（S6）均采集于新疆伊犁地区，经中国科学院新疆生态与地理研究所研究员冯缨鉴定，均为芸香科植物芸香（Rata graveolens L.）的全草。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 分别称取芸香碱、茵芋碱、花椒毒素和白鲜碱，加甲醇制成每1 mL含芸香碱11.66μg、花椒毒素22.40μg、茵芋碱30.20μg和白鲜碱22.84μg的混合溶液，备用。

2.2 供试品溶液的制备 称取供试品0.5 g置锥形瓶中，加氨水4 mL浸润30 min，加二氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液40 mL，置于80℃水浴回流1 h，放冷，静置，过滤，蒸干，残渣用甲醇溶解并定量稀释至5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈-0.02 mol/L甲酸铵，梯度洗脱（0～10 min，21∶79；10～15 min，25∶75；25～30 min，30∶70；30～35 min，35∶65；35～40 min，40∶60；40～45 min，45∶55；45～55 min，50∶50；55～60 min，21∶79）；流速为1.0 mL/min；检测波长为330 nm；柱温35℃，进样量为10μL。按上述色谱条件下，混合对照品和芸香样品中色谱峰可达到基线分离，见图1。

图1芸香样品HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 回归方程的建立 吸取“2.1”项下对照品溶液0.5、1、2、2.5、5、10 mL分别置于10 mL容量瓶中，定容至刻度，按“2.3”项下色谱条件测定，以峰面积值（A）对进样量（C）进行回归，绘制标准曲线，回归方程及线性范围,见表1。

2.4.2 精密度实验 吸取“2.2”项下供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件，连续进样6次，记录色谱峰峰面积，计算得到芸香碱、花椒毒素、茵芋碱、白鲜碱峰面积的RSD分别为1.37%，1.53%，1.48%，1.44%，表明仪器精密度良好。

表1线性关系考察结果（n=6)

2.4.3 稳定性实验 取“2.2”项下的供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，按“2.3”项下的色谱条件进样，记录色谱峰峰面积，计算得到芸香碱、花椒毒素、茵芋碱、白鲜碱峰面积的RSD分别为0.55%，0.32%，0.57%，1.46%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性实验 取同一批芸香按“2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱峰峰面积，计算得到芸香碱、花椒毒素、茵芋碱、白鲜碱峰面积的RSD分别为1.77%、1.56%、1.89%、1.47%，表明该方法重复性良好,见表2。

表2重复性考察结果/（mg/g）

2.4.5 加样回收率实验 称取已知含量的芸香6份，每份0.25 g，分别吸取“2.1”项下对照品溶液1.5 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱峰峰面积，计算得到芸香碱、花椒毒素、茵芋碱、白鲜碱的平均加样回收率分别为100.71%、95.25%、106.67%、93.86%，RSD分 别 为2.50%、3.38%、2.38%、0.88%，表明该方法准确度较高，见表3。

表3加样回收实验结果（n＝6）

2.5 样品含量测定 精密称取不同批次的芸香供试品粉末各0.5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱峰峰面积，计算样品中芸香碱、花椒毒素、茵芋碱、白鲜碱的含量，见表4。

表4含量测定结果/（mg/g）

3 讨论

通过紫外全波长扫描测定芸香碱、花椒毒素、茵芋碱、白鲜碱最大吸收波长分别为324 nm、348 nm、320 nm、348 nm，所以确定检测波长为330 nm。本实验还对3批次往年采集的芸香药材进行测定，发现各指标成分含量明显低于当年采收、阴干的样品。考虑指标成分受采收加工和贮藏方式的影响，应放于阴凉、通风、干燥处贮存，避免阳光曝晒。本研究采用HPLC法可实现对芸香药材中芸香碱、花椒毒素、茵芋碱和白鲜碱4种成分的良好分离和定量分析，且保留时间稳定、操作简便，可以为芸香药材的质量控制作为参考依据。