山杨柱头可授性及雌花枝质量对花芽发育影响

李静　郭成博　李正华　白卉

摘 要：最佳授粉时期的判定是山杨定向育种工程实施的关键技术环节，可以指导山杨授粉杂交，提高育种效率。本研究以在山杨优良种源中选取的优良单株为实验材料，采用柱头形态学观察，结合联苯胺-过氧化氢试剂法对其可授性进行研究，同时对不同长度、直径的雌花枝做保留不同叶芽和花芽数量处理、观测，分析其花序长度、千粒质量等指标，探讨花枝质量对花芽发育的影响。研究结果显示，在温室水培环境下，山杨雌蕊可授期持续3 d左右，雌蕊柱头外部形态特征与可授时期有一定相关性，花序松散伸长，柱头能够全部探出芽鳞，开裂角度约180°，呈红色且柱头分泌出大量晶莹透亮的黏液，联苯胺-过氧化氢染色出现大量气泡，柱头为深蓝色时是山杨最佳的授粉时期。柱头完全露出，湿润且分泌大量黏液的形态特征可以作为山杨雌蕊进入最佳可授期的标志信号，用来指导山杨杂交育种授粉。底端直径2 cm左右、长度2 m的花枝保留2～3个花序，保留1对顶端叶芽时最有利于花芽和种子发育。

关键词：山杨;最佳授粉时期;可授性

中图分类号：S792.11;S722.3   文獻标识码：A  文章编号：1006-8023（2021）02-0011-07

Study on Stigma Receptivity and Effects of Female Flowering Branches

Quality on Flower Bud Development of Populus davidiana

LI Jing， GUO Chengbo， LI Zhenghua*， BAI Hui*

（Heilongjiang Forestry Institute， Harbin 150081， China）

Abstract：The determination of the optimum pollination period was the key technology in the implementation of Populus davidiana directive breeding project， which can guide the hybrid pollination of populus davidiana and improve the breeding efficiency. Choosing Populus davidiana single plants selected from superior provenances as the research object， the stigma receptivity and optimal pollination period of Populus davidiana were studied by testing benzidine-H2O2 method and morphological observations. At the same time， female flowering branches with different lengths and diameters were treated with different leaf buds and flower bud number to observe and analyze inflorescence length， 1 000-grain weight and other indexes， to explore the influence of female flowering branches quality on flower bud development. The results showed that under a greenhouse condition， the stigma of the optimal receptivity stage of Populus davidiana was 3 d. The external morphological characteristics of the pistil stigma had a certain correlation with the receptive period. The optimal pollination period of Populus davidiana was when the inflorescence was loose and elongated， the stigma could all protrude out of bud scales， the cracking angle was about 180° and the stigma was red and secreated a lot of crystal clear mucus， benzidine-H2O2 staining appeared a lot of bubbles， and the stigma changed to deep blue. The morphological characteristics of stigma fully exposed， moist and secreting a lot of mucus could be used as a signal of the optimal pollination period of Populus davidiana， which could be used to guide the cross breeding and pollination of Populus davidiana. There was the best for flower bud and seed development that flower shoot retain 2 to 3 inflorescences and retain the only one pair leaf bud at the top with the bottom diameter was 2 cm and length was 2 m.

Keywords：Populus davidiana; optimal pollination period; stigma receptivity

收稿日期：2020-11-04

基金项目：黑龙江省森工总局青年基金项目 （sgzjQ2016002）;国家林业和草原局林业科技发展项目（KJZXZF2019005）;黑龙江省省属科研院所基本科研业务费专项（2012-04）

第一作者简介：李静，硕士，助理研究员。研究方向为杨树倍性育种。E-mail： muerliji@163.com

通信作者：白卉，博士，研究员。研究方向为林木遗传育种。E-mail： baihui1979@163.com

并列通信作者：李正华，硕士，副研究员。研究方向为细胞生物学。E-mail： 115491310@qq.com

引文格式：李静，郭成博，李正华，等. 山杨柱头可授性及雌花枝质量对花芽发育影响[J].森林工程，2021，37（2）：11-17.

LI J， GUO C B， LI Z H， et al. Study on stigma receptivity and effects of female flowering branches quality on flower bud development of Populus davidiana[J]. Forest Engineering，2021，37（2）：11-17.

0 引言

山楊（Populus davidiana ）属于白杨派树种，用途广泛，适生范围广，主要分布于：20～55° N，100～135° E，垂直分布海拔为200～3 500 m，东北、华北、西北、华中乃至西南的众多省区，全国 23 个省区分布的山杨总面积可达200万hm2以上。其材质洁白、轻软富弹性，结构、纹理和纤维素含量等指标较其他杨树树种优势明显，造纸时不加填充料，工艺简单[1]，成品纸张品质极佳。但天然山杨林心腐严重，未经选育的山杨植株生长缓慢[2]。因此，山杨优良品种的选育对适生区人工林营建和高品质木材生产均具有重要意义[3]。传统的选优、杂交等育种方式难以满足现阶段山杨遗传改良需求，多倍体育种能最大幅度综合杂种优势和倍性优势，发挥其在林木遗传改良作用，这是山杨良种培育行之有效的捷径[4-6]。

植物雌蕊柱头的可授期代表柱头发育的一个阶段，并不仅仅局限于特定的时间点，短则几小时，长则十几天。植物最佳授粉时间的准确判定是保证杂交成功的关键因素之一。通过植物柱头可授性的研究，明确雌蕊柱头的最佳授粉时期，不仅可以减少授粉工作量，而且还可以大大提高杂交的成功率。在育种工作方面已有通过可授期研究提高杂交效率的报道[7]。雌蕊柱头可授性的检测方法很多，其中定期授粉观察花粉萌发较准确，可靠程度高，但需要的时间相对较长。当植物雌蕊柱头具有可授性时，柱头表面往往伴随着高度的酶活性，目前已发现一些酶和蛋白的存在与柱头可授性的获得，与丧失变化相一致，基于柱头酶活性鉴定而建立的联苯胺-过氧化氢法应运而生，现已广泛应用于杨树、油棕、木槿和风箱果等多种植物柱头可授期和最佳授粉期检测[8-10]。雌蕊柱头可授期以及最佳授粉时期的明确可以减少工作量，精准指导杂交，提高育种效率和杂交成功率，进而提高综合杂交和多倍体优势的诱变育种中突变体获得比率，构建高质量、大基数的品种选育群体，成功实现纤维用材林的育种目标，是山杨定向育种工程实施的关键技术环节。大多数生殖期山杨优良种源的株高较高使得取材不便，为了更好地利用优良资源，本研究对不同规格雌花枝做不同处理后对花芽长度、千粒质量等进行观测分析，探讨花枝质量对花芽发育的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究使用的山杨植株取于牡丹江林口县青山林场内山杨优良种质资源保存林。

1.2 试验方法

1.2.1 花枝的采集

2月下旬选择雌雄株优树，采集树冠中上部、向阳面和花芽发育饱满的枝条，花枝直径为0.5、1、1.5 cm，长度为1、1.5、2 m，采集的花枝用塑料膜包裹严密，在-5～3 ℃低温中贮藏备用。

1.2.2 花枝质量对花芽发育影响正交实验设计

为探讨花枝质量对花芽发育影响，以花枝长度、花枝下端直径、叶芽保留数量和花芽保留数量为因素，做了四因素三水平正交实验设计（L934），统计授粉期花芽长度和千粒质量衡量花芽发育质量以及种子质量，每组实验3次重复，见表1。

1.2.3 雌花枝的培养

低温贮藏的雌花枝水培前需预处理，将长势差、过密和徒长无花芽的枝条修剪掉，2～3 d换一次水。温室水培时温度保持在白天20～25 ℃，夜晚10～15 ℃。

用于可授性试验的花枝根据最利于花芽发育的组合进行处理。

1.2.4 雄花枝的培养和花粉的采集

水培前需与雌花枝一样整枝，具体做法和水培条件参照1.2.3。雄花枝比雌花枝提早一周水培，水培后勤观察，及时收粉，用硫酸纸做成漏斗，轻抖小枝，动作轻柔将花粉收集到玻璃小瓶中，在瓶中加入变色硅胶干燥剂，4 ℃冰箱低温冷藏备用。

1.2.5 雌蕊的观测

3月中旬，将雌花枝置于温室内水培，从水培第2天开始，每隔6 h采集雌蕊中上部柱头，用镊子取下，随取随测，每次检测5朵花，试验重复3次。

雌蕊柱头外部形态变化用体式显微镜（SMZ-140n2gg）观察并拍照记录。

可授性检测采用李艳华等[11]和王君等[12]的联苯胺-过氧化氢法。反应液现配现用，在体视显微镜下观察气泡产生情况以及柱头变色情况，若柱头周围变为蓝色并有气泡产生，则记为柱头具有可授性，若柱头周围变为深蓝色并迅速产生大量气泡，则记为柱头为最佳可授期。

1.3 数据处理与分析

本试验数据用Excel 10.0进行表格统计记录，用SPSS 19.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 花枝质量对花芽和种子发育影响

正交试验结果见表2。

利用正交设计对试验结果均值进行直观分析，结果见表3。极差R反映了影响因素对花序长度的影响，R值越大，影响越显著。由表3可知，该试验水平内各因素水平的变化对花序长度的影响由大到小依次为：花枝下端直径、花枝长度、叶芽保留数量、花芽保留数量。

每一因素水平下的均值反映了影响因素各水平对花序长度的影响情况，均值越大，反应水平越好。从表 3可以看出，4个影响因素的最佳组合并没有在正交表中出现，用SPSS软件对试验结果进行方差分析及多重比较，结果表明各因素的影响由大到小依次为：花枝下端直径、花枝长度、叶芽保留数量、花芽保留数量，该结果与极差分析相一致（表4）。经多重比较可知，花序长度在A3水平，即花枝长度为2 m时最长，与其他2个水平的差异显著;花枝下端直径B3水平，即1.5 cm最佳;叶芽保留数量C3水平，即仅顶端保留1对最佳;花芽保留数量D3水平最好，即保留2～3个最好，但水平2和水平3之间差异不显著。根据各水平的多重比较，得出影响花序长度的最佳组合：A3B3C3D3，即花枝长度为2 m，花枝下端直径为1.5 cm，叶芽保留数量为仅顶端保留1对，花芽保留数量为2～3。

从表3可知4个影响因子对千粒质量的直观分析结果表明，各因素水平的变化对千粒质量的影响由大到小依次为：花枝长度、花枝下端直径、花芽保留数量、叶芽保留数量。方差分析及多重比较结果见表5。SPSS分析结果与直观分析结果一致。经多重比较可知，千粒质量在A3水平，即花枝长度为2 m时最大，且与其他两个水平的差异显著;花枝下端直径B3水平，即1.5 cm最佳;叶芽保留数量C3水平，即仅顶端保留1对最佳，但水平2和水平3之间差异不显著;花芽保留数量D3水平最好，即保留2～3个最好，且水平2和水平3之间差异不显著。根据各水平的多重比较，得出影响千粒质量的最佳组合：A3B3C3D3，即花枝长度为2 m，花枝下端直径为1.5 cm，叶芽保留数量为仅顶端保留1对，花芽保留数量为2～3个。不同长度、直径的雌花枝保留叶芽和花芽数量的不同能够影响了花序长度、千粒质量等指标。

2.2 雌蕊柱头可授性及最佳授粉期判定

山杨雌蕊柱头可授性和最佳授粉期的判定是提高杂交效率、保证杂交质量的有效途径。相关研究以证明联苯胺-过氧化氢法是检测杨树可授性的有效方式[13-16]。

本实验结果表明，山杨在温室水培条件下雌蕊可授期持续3 d左右，雌蕊柱头形态特征与可授性和最佳可授时期存在一定程度相关性。从表6可以看出，水培至186 h，花序紧密，柱头紧密连接、未展开，且光滑无黏液附着，颜色呈浅红色，经试剂反应液测试未产生气泡，颜色无变化，此阶段雌蕊为非可授期;水培至192 h，花序伸长微露柱头，柱头裂开角度小于30°，表面分泌有少量黏液，颜色呈红色，经试剂反应液测试仍未产生气泡，颜色无变化。水培至204 h，花序继续伸长露出柱头，柱头开裂角度大于60°，表面均匀分布着一层黏液，柱头颜色仍為红色，经试剂反应液测试产生少量气泡，柱头显色为蓝色，标志着山杨雌蕊柱头具有可授性，雌花进入可授期。水培至216 h，花序松散，柱头完全露出，柱头开裂角度加大至180°，此时肉眼即可观测到雌花柱头莹润透亮，伴有大量黏液分泌，放入反应液检测时柱头迅速产生大量气泡，柱头染色变为深蓝色，此时可授性最强，进入最佳授粉期。继续温室水培至276 h，花序伸长至最长，柱头颜色变暗淡呈红褐色，干燥无黏液并有萎蔫的趋势，经试剂反应液测试不再有气泡产生，此阶段雌花序已经失去活力，不再具可授性。如图1和图2所示。

3 结论与讨论

不同长度、直径的雌花枝保留叶芽和花芽数量的不同直接影响了花序长度、千粒质量等指标。通过这2个指标初步探究了花枝质量对花芽发育的影响，长度越长、底端直径越粗的花枝，保留2～3个花序，顶端保留1对叶芽时最有利于花芽和种子发育。在试验过程中保留全部花芽的枝条，花芽发育到一定阶段就停止生长进而萎蔫脱落，花序量大并没有实现种子量大，而且结出的部分种子干瘪，活力差。育种实践中花序长度达到一定程度代表着花序发育情况好，更有利于结种，而千粒质量大的种子发育一般情况下也比质量小的更有优势。仅保留1对顶端叶芽满足植物蒸腾拉力，维持养分运输，又不过多消耗养分利于水培枝条发育与试验结果吻合。实验结果表明，长度2 m、底端直径2 cm的花枝，保留2～3个花序和1对顶端叶芽时最有利于花芽和种子发育。但考虑到野外取样时长度太长不便于运输，可结合实际情况考虑花枝缩短长度至1.5 m。

雌蕊柱头是雌蕊顶端接受花粉的部位，其表面形态和生理特征影响着花粉的粘附[17-20]，山杨柱头依靠分泌出的一定数量的黏液来获取空气中飞扬的花粉完成自然授粉过程，属于风媒授粉，这是自然演化的结果[21]。实验结果显示，山杨雌蕊柱头可授性与柱头发育及其形态变化具有密切联系，通过对柱头形态的观测对其可授性进行估测具有可行性，当花序松散，柱头完全露出，晶莹透亮、湿润、均匀分布有大量黏液的形态特征可以作为山杨雌蕊进入可授期的标志信号，更简便快捷的指导山杨授粉，而联苯胺-过氧化氢试剂柱头染色深蓝色，迅速出现大量气泡的时期为山杨最佳的授粉时期，可以更加精准指导杂交，提高育种效率和杂交成功率。

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