基于NGAL的模型在肝硬化急性肾损伤早期诊断和鉴别诊断中的意义

尹伟 李成忠

在国际腹水俱乐部《肝硬化患者急性肾损伤的诊断与管理专家共识(ICA2015)》[1]发布前，一些基于AKIN及KDIGO 标准的研究发现肝硬化患者并发急性肾损伤(AKI)可以涵盖AKI的所有类型[2,3]，以肾前性氮质血症(pre renal azotemia，PRA)、急性肾小管坏死(acute tubular necrosis，ATN)和肝肾综合征(hepatorenals yndrome，HRS)最为常见，其他类型发病率则相对较低。从这一角度看，2007年乃至以前指南的HRS诊断标准缺少针对性的鉴别。所以从临床的实际情况和肝硬化的病理基础出发，本次ICA诊断标准在以提高敏感性的同时，除了用肝硬化急性肾损伤的概念来代替狭义的HRS外，还将鉴别诊断和个体化治疗放到同等重要的位置上。根据新指南建议，需对AKI 2期以上或1期经过治疗肾功能无恢复、且SCr>132.6 μmol/L的患者进行鉴别诊断。由于1型HRS和ATN短期内进展的速度相当快而治疗方法却截然不同，所以指南也希望在未来的研究中通过一些新的生物学标志物提高早期诊断及鉴别诊断的敏感性以免延误治疗。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是人脂质运载蛋白家族的新成员。1993年由Kjeldsen发现并命名[4]。在生理状态下，NGAL在中性粒细胞及肾脏上皮细胞有微量表达。当肾脏发生局部缺血或损伤时，NGAL会由肾脏大量分泌，并进入尿液及血液中。既往的研究发现，肾损伤发生2 h后，血、尿NGAL浓度即可明显升高，这一特性使得NGAL成为肾脏疾病尤其是AKI的早期标志物[5]。

资料与方法

一、病例资料

收集2017年1月至2019年1月在海军军医大学长海医院感染科住院的所有肝硬化(失代偿期)的患者资料, 对住院期间的患者资料进行登记，监测住院期间的血肌酐变化，如符合肝硬化急性肾损伤的诊断标准，同时进行AKI分期。多次入院的患者仅记录一次。

肝硬化急性肾损伤及肝肾综合征诊断标准：参考2015年国际腹水俱乐部修订推荐的《肝硬化患者急性肾损伤的诊断和管理共识》。

急性肾小管坏死的诊断标准：参考文献[6]。由于肝硬化(失代偿期)患者存在长期利尿、低血钠等情况，所以滤过钠排泄分数，尿钠等指标的参考意义较差，诊断需要综合病因及以上指标判断。

排除标准：肝癌或罹患其他恶性肿瘤的患者；严重的其他心肺系统疾病；既往患有不同原因慢性肾脏病的患者和结构性肾损伤患者；没有肝硬化基础的慢加急性肝功能衰竭患者；妊娠期或哺乳期患者；慢性代谢性疾病如原发性醛固酮增多症等患者。

二、研究方法

患者的资料采集：住院ID，年龄、性别、原发病病因、血压(入院及并发AKI时)、肝功能指标(TBil、Alb、ALT、AST、血清钠)、肾功能指标(SCr)、凝血功能(PT、INR)、醛固酮及血管紧张素Ⅱ、是否合并感染、感染类型、PCT、是否有AKI、AKI的类型。

标本收集和保存：患者首次诊断为肝硬化急性肾损伤后，取24 h内晨起中段尿，用无菌管收集，离心20 min(2000～3000 r/min)。收集上清-80℃冻存。

人uNGAL的检测：试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司，Human Lipocalin-2/NGAL Quantikine ELISA Kit(R&D System,批号：20180106，20180604，20181219)，按照试剂说明书操作。

三、治疗方法

一般治疗：积极治疗原发疾病，保肝、利尿、抗感染、抗病毒、营养支持等，白蛋白低于35 g/L补充白蛋白等。

AKI的鉴别诊断和治疗：根据ICA2015诊治共识的建议流程进行，根据患者的不同情况进行调整，对白蛋白正常或存在活动性上消化道出血的患者并发AKI，白蛋白的剂量酌减。

四、统计学方法

结 果

一、uNGAL在肝硬化急性肾损伤患者中的表达

共纳入肝硬化(失代偿期)患者804例，住院期间并发AKI或入院即存在AKI的患者216例，其中资料齐全的病例127例，纳入10例肝硬化失代偿但未并发AKI的患者为对照。结果显示，肝硬化AKI患者的uNGAL为(462.72±265.42) ng/mL；未发生AKI的患者的uNGAL为(108.40±63.07) ng/mL。两组比较差异有统计学意义(t=11.439,P=0.000)。

二、uNGAL在不同AKI类型患者中的表达

不同的AKI类型uNGAL的表达水平不同，PRA为(323.08±106.93)ng/mL; HRS为(486.27±164.67)ng/mL；ATN为(882.43±440.92)ng/mL，差异有统计学意义(F=48.774,P=0.000)；不同AKI类型uNGAL水平的组间比较差异均有统计学意义(PRA比HRS：标准误为38.16；PRA比ATN：标准误为56.98；HRS比ATN：标准误为57.09，均P<0.01)。

由于不同AKI分期的AKI类型分布不同，根据AKI分期进行的亚组分析(表1)， AKI 1期诊断PRA 50例，HRS 14例，ATN 0例，NGAL分别为(306.79±70.88)、(331.81±67.73) ng/mL和0，差异无统计学意义(F=，P=0.243)。AKI 2期诊断PRA、HRS、ATN的NGAL分别为(358.84±64.11)、(512.74±148.85)和(747.94±239.20) ng/mL，差异有统计学意义(F=，P<0.01)。AKI 3期诊断PRA 0例，HRS 7例，ATN 6例，NGAL分别为0、(640.10±159.70)和(1136.71±593.18) ng/mL，差异有统计学意义(F=，P=0.046)。未发现ATN患者，两项比较尿NGAL的差异无统计学意义；AKI 2期患者整体分析uNGAL的差异有统计学意义，但从组间比较看类似1期的结果，PRA和HRS的uNGAL差异无统计学意义(标准误：73.86，P=0.125)，而HRS、PRA和ATN比较差异有均统计学意义(PRA vs ATN：标准误：84.46，P=0.000；HRS vs ATN，标准误：57.94，P=0.000)；3期无PRA的患者，结果显示ATN的uNGAL比HRS明显升高，但由于3期的患者病例数较少(HRS 7例；ATN 6例)，差异的结果虽有统计学意义但在0.05附近(P=0.046)。综合分析：对于AKI 2期以上的患者，uNGAL对鉴别诊断ATN和非ATN型急性肾损伤意义较大；在AKI 1期和2期，早期通过uNGAL的水平，难以鉴别HRS和PRA。

从表2的结果看醛固酮和血管紧张素Ⅱ在不同类型的AKI患者中整体表达水平不同，但组间比较提示醛固酮的水平仅对PRA鉴别ATN有意义(标准误：35.03，P=0.001)，PRA和HRS组的差异接近0.05(标准误：22.77，P=0.051)；血管紧张素Ⅱ水平在鉴别PRA及非PRA型AKI有意义(PRA vs HRS：标准误17.72，P=0.002；PRA vs ATN:标准误：27.27，P=0.000)。在HRS组和ATN组，醛固酮(标准误：35.03，P=0.113)和血管紧张素Ⅱ(标准误：27.27，P=0.063)的表达水平差异均无统计学意义。

三、以uNGAL为基础的早期鉴别诊断系统

将基线SCr、初次AKI分期、uNGAL、醛固酮、血管紧张素Ⅱ纳入二元logistic回归，得到鉴别ATN的预测方程，通过ROC曲线计算约登指数确定阈值。

表1 醛固酮和血管紧张素Ⅱ在不同AKI类型患者中的表达

表2 HRS和ATN的鉴别诊断的多因素分析

图1 NGAL诊断ATN的ROC曲线

结果显示：uNGAL是鉴别诊断ATN和HRS的独立因素。ROC曲线分析(图1)：uNGAL诊断ATN的ROC曲线下面积(AUC)为0.857，约登指数为522.72 ng/mL，敏感度为0.938，特异度为0.655。但此时特异度较低，如将特异度确定为0.800，则阈值为621.73 ng/mL，此时的敏感度为0.750，更符合临床的需要。

讨 论

国际腹水俱乐部对本次的指南进行了重大更新，在扩大概念的同时也强调了鉴别AKI类型的重要性，其中ATN和HRS的鉴别仍是待解决的关键问题之一。由于肝硬化(失代偿期)患者常合并低蛋白血症、低钠血症或同时使用高渗性利尿剂，ATN的诊断较为困难，所以指南中也建议通过新的生物学标志物辅助鉴别诊断。结合国外前期的部分探索，选择了uNGAL作为早期鉴别诊断的关键因子。

以往的研究中显示，NGAL的升高和AKI及AKI进展有关，比SCr更为敏感[7,8]。Kim等[9]证实了NGAL与sCr在诊断和分期中的敏感性，对于疑似败血症的重症患者，pNGAL与序贯器官衰竭评估的肾亚组明显相关性明显优于sCr。而Hekmat等[10]对单侧肾脏切除的器官捐献者的评估显示，一半的患者出现AKI， NGAL随着AKI的进展而升高，其敏感性优于胱抑素C。NGAL的表达水平与AKI的进展相关，但作为诊断标准应用于肝硬化AKI的患者仍存在很多需要解决的问题，除了目前检测方法还不统一，阈值的确定和检测的时机是需要重点考虑的。

uNGAL的检测结果显示肝硬化AKI患者中表达水平明显升高，相较于普通肝硬化失代偿期患者差异有统计学意义。提示早期检测uNGAL对于发现肝硬化AKI也有诊断价值。NGAL对AKI的诊断价值在多种疾病中已被证实[11-14]，在肝硬化AKI患者中也有过早期的探索。Verna等[15]曾使用2007年ICA肝肾综合征的诊断标准来验证尿NGAL的表达，结果显示HRS患者的uNGAL水平在PRA患者和固有急性肾损伤(intrinsic acute kidney injury，iAKI)患者之间。Fagundes等[16]比较了肝硬化代偿期，失代偿期以及肝硬化合并肾损伤患者(包括PRA,HRS,ATN,CKD)uNGAL的水平，结果显示，ATN患者的uNGAL表达要高于PRA、HRS和CKD的患者。Belcher等[17]在此基础上应用KIDGO标准设计了一项多中心的前瞻性研究，测量了多种标志物(NGAL,KIM-1,IL-18,L-FABP)诊断ATN和非ATN型AKI的水平，结果显示NGAL、IL-18、KIM-1、L-FABP和白蛋白的表达在ATN和非ATN患者中均有明显的差异。ROC曲线显示NGAL的曲线下面积最大(AUC=0.78)。基于此项研究，ICA在发布新指南中也对建议通过新的生物学标志物来加强鉴别诊断的特异性。Ariza等[18]检测了肝硬化和慢加急性肝衰竭患者的多种标志物(AKI诊断采用AKIN标准，HRS诊断采用ICA2007标准)，结果发现在PRA、1型肝肾综合征和ATN的患者中NGAL的表达水平有差异，其他对诊断ATN有意义的标志物有IL-18、白蛋白、TFF-3和GST-π，而KIM-1、β2微球蛋白等准确性较差。

本研究根据不同的AKI类型进行分组，uNGAL的表达水平各不相同。发现uNGAL随着AKI进展持续升高，而3期患者多入院即存在AKI，缺失了早期的观察，因此对于AKI 2期的鉴别诊断更为重要，尤其ATN的确定是重中之重。对AKI 2期患者的分析发现uNGAL在PRA、HRS和ATN的表达水平各有差异，但PRA和HRS的差异不明显。说明uNGAL对鉴别ATN和非ATN型AKI有重要的意义。本研究还设计了血管紧张素Ⅱ和醛固酮的检测作为辅助鉴别诊断HRS的预选因素，但结果显示醛固酮和血管紧张素Ⅱ虽然在三种AKI类型的患者存在表达差异，但进一步分析显示这两种激素的水平仅对鉴别PRA和非PRA的患者有意义，其中醛固酮的意义更低。多因素分析也显示以上两种激素水平对鉴别HRS和ATN意义不大， uNGAL是鉴别诊断ATN的独立因素。以约登指数确定的诊断ATN的uNGAL阈值为522.72 ng/mL，但此时敏感度较高，但特异度不足。Jaques等[19]一项前瞻性研究纳入了105例肝硬化(失代偿期)患者，其中55例确诊AKI，分别在3个时间点监测了SCr、胱抑素C，NGAL(血液和尿液)、尿钠、肾阻力指数(RRI)。结果显示，PRA患者显示比较低的SCr、NGAL和RRI；ATN患者有最高水平的NGAL、尿蛋白和尿钠，HRS位于二者之间，所有生物学标志物均和AKI的严重程度平行。

综上所述，虽然uNGAL可以早期辅助诊断肝硬化AKI，而且对ATN和非ATN型AKI有较高的鉴别诊断价值，但在临床上仍需要综合判断。遗憾的是由于ATN的患者病例数较少，且集中于2、3期，在AKI 1期的鉴别诊断意义仍然需要在未来的研究中进一步探讨。