含炔基官能团的咪唑盐类聚离子液体抗菌剂的制备与表征*

生程钜，闻林林，周超，邓林红△

(1.常州大学材料科学与工程学院，常州 213164；2.常州大学生物医学工程与健康科学研究院，常州 213164)

1 引 言

自然环境中存在大量的细菌和有害微生物，如果人体表面受伤后，伤口未得到及时处理，受到细菌感染，就会导致一系列的炎症反应，影响伤口愈合，甚至危及生命安全。尤其是糖尿病患者的伤口，由于周围皮肤毛细血管阻塞，伤口愈合周期较长，更易受到细菌感染。对于这些长期难以愈合的伤口，传统的抗菌敷料很难达到理想的抗菌效果[1-2]，这是由于其采用的抗菌剂(如金属离子，抗生素等)存在细胞毒性或耐药性等问题[3]。

近年来，咪唑盐类聚离子液体作为聚合物抗菌剂显示了较强的广谱抗菌性能和较低的生物毒性等优点[4-6]。聚离子液体利用其表面富集的阳离子基团，与细菌细胞壁所带的负电荷通过静电作用吸附在细菌表面，抗菌剂的疏水链端刺入细胞壁，导致细胞膜结构破裂，使细菌裂解消亡。各种咪唑盐类聚离子液体已被证明可以有效杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，甚至可以杀死耐药细菌，如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)[7-11]。但是，它们中的大多数仍采用卤素(氯化物，溴化物，碘化物)或重金属(锌，铜)作为络合剂，这些成分可能会在体内生物富集并危害正常细胞，不利于作为长期使用的辅料抗菌剂[12-13]。

因此，本研究采用毒性更低的炔基作为阴离子络合剂，通过缩聚反应合成不同主链结构的含炔基咪唑盐类聚离子液体。实验表明，以该方法制得的抗菌剂，不仅具有高效的抗菌性能，还具有较低的细胞毒性和较好的生物相容性，可用于临床医用抗菌敷料中。

2 实验部分

2.1 材料与主要试剂

2.1.1材料与主要试剂 1,4-二溴丁烷(1,4-dibromobutane)，99%，阿拉丁生化科技股份有限公司，中国上海。1,2-双(2-溴乙氧基)乙烷(1,2-Bis(2-bromoethoxy)ethane),99%，T&W GROUP，中国。丙炔酸钠(Propiolic Acid Sodium Salt),99%，百灵威科技有限公司，中国。MH和LB培养基，索莱宝公司，美国。磷酸盐缓冲溶液(PBS)、活-死细菌染色试剂盒、Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒，碧云天生物技术有限公司，中国。胰蛋白胨、特殊的DMEM高糖、胰蛋白酶，Thermo Fisher Scientific，美国。酵母粉和琼脂粉，润捷化学试剂有限公司，中国。透析袋，MWCO=1000 Da，光谱医学，美国。甲醛(CH2O，分析纯)，乙二醛(C2H2O2,40%，化学纯)，盐酸(HCl,37%), 浓硫酸(H2SO4,98%), 无水乙醇(C2H5OH)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，氢氧化钠(NaOH)，国药集团化学试剂有限公司，中国。

2.1.2实验仪器 冷冻干燥机，2.5 L，德国Freezone公司。pH计，PB-10，德国Sartorius公司。倒置式显微镜，Primo Vert，德国Carl Zeiss公司。超净工作台，VS-1300L-U，美国AIRTECH公司。核磁共振波普仪，AVANCEⅡ500M，德国布鲁克。傅里叶红外光谱仪，Nicolet A vatar 370, 美国Thermo Fisher。荧光显微镜，AMF4300, 美国Thermo Fisher。激光粒度仪，ZEN 3600，英国Malvern公司。

2.2 聚丁基咪唑丙炔酸盐聚离子液体(PIMB)的和聚二氧杂辛烷咪唑丙炔酸盐聚离子液体(PIME)的合成

首先，根据先前公开的方法[14]制备两种不同分子量大小的典型的咪唑鎓聚合物：聚(N-丁基咪唑鎓溴化物)，聚(N-(3,6-二氧杂辛烷)咪唑鎓溴化物；其次，将丙炔酸钠与1,4-二溴丁烷或1,2-双(2-溴乙氧基)乙烷以摩尔质量比3：1混合，并与上述咪唑鎓溴化物发生离子交换，反应方程式见图1；最后，使用透析袋(MWCO=1000 Da)将混合物用水透析24 h，以除去过量的丙炔酸钠。

图1 PIMB和PIME的合成Fig.1 Synthesis of PIMB and PIME

2.3 含炔基咪唑盐类聚离子液体化学结构表征

以D2O为溶剂对PIMB和PIME进行红外光谱(FT-IR)表征和核磁共振(1HNMR)表征;PIMB和PIME的电位和粒径由ZEN3600激光粒度仪测定(0.5 mg/mL)。

2.4 含炔基咪唑盐类聚离子液体的抗菌性能测试

首先，在96孔板的每孔中加入三蒸水100 μL；其次，在第1行分别加入500 μg/mL的PIMB和PIME溶液，采用2倍稀释法依次稀释至下一行；接着，向每孔加入100 μL大肠杆菌悬液或金黄色葡萄球菌悬液，混匀后，放入37℃恒温培养箱培养24 h，并用无PIMB和PIME组做为对照；最后，使用酶标仪测量600 nm处的OD值，同时用细菌活死染色试剂盒对其进行染色，以绿光标记活细菌，红光标记死细菌。PIMB和PIME的MIC值是指抑制90%的大肠杆菌的最小浓度。杀菌率的计算见式(1)：

(1)

2.5 含炔基咪唑盐类聚离子液体的细胞毒性测试

首先，将聚合物样品(PIMB和PIME)用PBS缓冲液进行溶解，分别配成13.5 mg/mL的溶液；其次，在96孔板上将100 μL聚合物样品溶液和100 μL成纤维细胞悬浮液(5×104cells/mL)混合，以100 μL的1X PBS为空白对照；接着，在5%CO2气氛中于37℃孵育48 h，然后向孔中加入10 μLCCK-8溶液并孵育1 h；最后，使用酶标仪测量450 nm处的OD值。同时用罗丹明和DAPI对细胞进行染色，通过观察细胞的形态来判断细胞的毒性。细胞存活率的计算见式(2)：

(2)

3 结果与讨论

3.1 含炔基咪唑盐类聚离子液体的化学结构表征

由图2(a)可知，PIMB和PIME的红外谱图在2 200 cm-1处均出现炔基的特征峰，在1 700 cm-1处有C=O的伸缩振动峰，PIME的谱图在1 200 cm-1处有C—O的特征峰，而PIMB的谱图中并未出现此特征峰，证明两种物质的聚合反应均已成功。图2(b)为PIMB和PIME的核磁共振氢谱表征，其中左图为聚离子液体PIMB各峰归属：8.3 ppm为咪唑环上—CH—的化学位移，7.4 ppm为咪唑环上—CH2—的化学位移，4.2 ppm为咪唑环邻位—CH2—的化学位移，1.8 ppm为主链结构丁二胺—CH2—的化学位移。右图为聚离子液体PIME各峰归属：8.3 ppm为咪唑环上—CH—的化学位移，7.4 ppm为咪唑环上—CH2—的化学位移，3.7 ppm为咪唑环邻位—CH2—的化学位移，3.5 ppm为主链结构二氧杂辛烷—CH2—的化学位移。

图2 (a).PIMB和PIME的红外光谱图;(b).PIMB和PIME的核磁氢谱图 Fig.2 (a).FT-IRof PIMB and PIME;(b).1HNMR of PIMB and PIME

3.2 含炔基咪唑盐类聚离子液体的粒径和电荷大小测量

由图3(a)可知，所制备的聚离子液体PIMB和PIME的特征粒径分别在128 nm和142 nm，这与PIME的分子量大于PIMB相符[15]。图3(b)为聚离子液体PIMB和PIME的Zeta电位测试结果，可见PIME所带电荷量大于PIMB。

图3 (a).聚离子液体PIMB和PIME的粒径分析图;(b).聚离子液体PIMB和PIME的Zeta电位图(n=4, *P≤0.05)Fig.3 (a).Particle size analysis diagram of PIMB and PIME;(b).Zeta potential diagramof PIMB and PIME(n=4, *P≤0.05)

3.3 含炔基咪唑盐类聚离子液体抗菌能力和细胞毒性测试

PIMB和PIME的抗菌能力测试见图4，细胞毒性测试见表1。

图4 (a).PIMB和PIME作用前后细菌的荧光染色抗菌测试;(b).PIMB和PIME作用前后细菌的细胞染色图Fig.4 (a).Fluorescence staining antibacterial test exposure to PIMB and PIME;(b).Cell staining image exposure to PIMB and PIME

表1 PIMB和PIME的抗菌能力和细胞毒性Table 1 Antibacterial and cytotoxic of PIMB and PIME

由图4(a)可知，在PIMB和PIME作用120 min之后，细菌的荧光染色由绿色变为了红色，表明两种含炔基咪唑盐类聚离子液体在120 min内，能有效杀死细菌。含炔基咪唑盐类聚离子液体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能见表1，结果显示两种聚离子液体都能有效杀灭大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)，这是由于含炔基咪唑盐类聚离子液体中正电荷的咪唑盐官能团与带有负电荷细菌细胞壁/膜表面相互吸引，通过静电作用粘附到细菌表面，抗菌剂的疏水部分(如烷基链)插入细菌细胞壁/膜的疏水区域，对其进行扰动，导致细菌细胞结构被破坏，最后细菌裂解而亡[8]。比较两种物质的MIC发现，PIME的抗菌性能高于PIMB，这也符合上述Zeta电位的测试结果。

此外，对于抗菌材料而言，其细胞毒性的大小是必须检测的性能，通过CCK-8试剂测定了含炔基咪唑盐类聚离子液体对人体皮肤的成纤维细胞的毒性。实验结果表明，所有含炔基咪唑盐类聚离子液体的细胞存活率均大于90%，表现出良好的细胞相容性，见表1。并且，通过将两种含炔基的咪唑盐类聚离子液体和细胞共培养48 h后的荧光染色图可知，两者对细胞的细胞状态并无影响，见图4(b)。

4 结论

本研究主要通过缩聚反应制备不同主链结构的含炔基的咪唑盐类聚离子液体，并对其化学结构、细胞毒性和抗菌性能进行了一系列表征。实验结果表明，含炔基的咪唑盐类聚离子液体由于其较强的正电效应，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较强的抗菌性，而且对人体皮肤的成纤维细胞具有较低的细胞毒性，未来可作为一种生物相容性较好的抗菌剂，广泛应用于医用敷料中。