基于栅藻延迟发光检测的不同产地及炮制方式连翘评价方法初探*

荆绮,杨美娜,庞靖祥，闵令圆,韩金祥△

(1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)生物医学科学学院，济南 250062；2.山东省医药生物技术研究中心，济南 250062)

1 引 言

生物光子辐射又称为超微弱生物发光(UPE)广泛存在于各类生物体中，是一种极其微弱的低水平化学发光，波长范围在 200 ～ 800 nm，对生物体内部的微小变化非常灵敏，与生物体内的信息传递、光合作用、细胞分裂等基本生命过程密切相关，能够在一定程度上反映生物体内物质代谢水平[1-2]。生物超微弱发光检测技术具有非破坏性、非侵入性、能提供时空信息等优势。因此，在医学研究[3-5]等领域得到广泛应用。

研究表明，生命物质中多模光子辐射与集体生物分子之间的一种相干非线性相互作用是生物光子发生的主要机制[1]，表明生物光子辐射强弱是生命体内部整体代谢变化的表现，中医药整体性理论与生物光子相性理论存在可通约性，有研究提出可将生物光子相干性理论等现代理论与中医药理论进行融合[6-7]。基于栅藻延迟发光初步表征中药寒热药性的生物指示剂法是将不同寒热药性的中药煎煮液加入栅藻指示剂中，通过对比加入中药煎煮液前后的栅藻K值来量化表征中药药性[4，8]。该方法灵敏简便，可操作性高。本研究以中药连翘为实验对象，利用栅藻生物指示剂法，探究分别加入5个产地、两种不同炮制方式的中药连翘煎煮液后栅藻生物指示剂的K值变化，得到K值的主要波动范围，对不同产地及两种炮制方式的连翘药材药性进行评价。

2 材料和方法

2.1 实验仪器及材料

2.1.1仪器设备 光照培养箱、超净工作台、U-3900H紫外分光光度计、YPMS-2生物光子测量仪、PM20SP型光电倍增管高压电源、ACCULAB电子天平、尚朋堂电陶炉、石英比色皿、康舒砂锅。

2.1.2供试生物 栅藻(Scenedesmus sp．) 自中国科学院武汉水生生物研究所采购(编号 FACHB-933) ，使用 BG11 培养基进行培养。

2.1.3连翘产地及炮制方式 山西安泽清蒸和生晒各4批次；河南清蒸4批次；河南生晒1批次；山东生晒1批次；陕西商洛清蒸3批次；陕西商洛生晒1批次；河北清蒸1批次。

2.2 方法

2.2.1栅藻培养及浓度测定 选取生长状态良好且处于对数生长期的栅藻，将其接种于加入BG11 培养基的高压灭菌的锥形瓶( 500 mL) 中，光照培养箱温度25℃、光照强度4 000 Lux、光暗比为12∶12 h进行培养，培养 20 d后进行转接，转接比例为1∶5( 藻液: BG11 培养基)，按上述方法继续培养[8-9]；栅藻使用前需混匀藻液进行浓度测定，取4 cm×1 cm×1 cm的石英比色杯，加入均匀藻液3 mL，设定U-3900H紫外分光光度计波长为 680 nm测量藻液的吸光度，控制栅藻吸光度A=2.5，即栅藻细胞浓度C=3.0×107个/mL[9]。

2.2.2连翘煎煮液的制备 电子天平精确称取10 g连翘，量筒量200 mL 水共同置于砂锅中，浸泡药材，30 min后，设置电磁炉功率为2 200 W，时间15 min，煎煮液剧烈沸腾后，减小加热功率至800 W，加热结束后，使用6层纱布过滤煎煮液，滤取滤液至250 mL烧杯中；将中药滤渣再次置于砂锅中，加入200 mL水，再次使用上述煎煮方法进行加热，加热结束后滤取滤液，弃中药滤渣。将两次煎煮液混合后置于砂锅中，设置电磁炉功率为2 200 W，加热至煎煮液沸腾后，减小加热功率至800 W，持续加热，直至煎煮液体积浓缩至50 mL,4℃保存24 h后使用[4，9]。

2.2.3中药煎煮液栅藻指示剂延迟发光测量 在石英比色杯中加入2.2.1条件下均匀栅藻溶液3 mL，取100 μL连翘煎煮液上清与藻液混匀，将该石英比色杯置于YPMS-2生物光子测量仪的暗室内，暗适应15 min，仪器设置为：光源白色LED；测量点900；选择测量方法DL；测量时间1.000000；光照时间10 s；重复次数7[8-9]，之后进行激发延迟发光的检测。

3 实验结果

3.1 数据处理分析[8-9]

使用软件statistica10.0处理激发延迟发光实验数据，运用式(1)进行“双曲”拟合，式(2)计算延迟发光平均强度(IW)，将 IW与t进行线性拟合，得到相应的线性拟合方程。其中斜率K表征了栅藻在不同的液体环境中延迟发光的动力学演化行为，可表征样品性质。

I(t)=A×csch2(t/B+C)

(1)

IW=A×B/W×[cothC-coth(W/B+C)]

(2)

其中，A为强度参量，B为特征时间，C为位相因子，W为总的测量时间。

3.2 各个产地两种炮制方式连翘煎煮液栅藻K值比较

将栅藻藻液加入石英比色杯中，在2.2.1条件下，吸取连翘煎煮液加入栅藻中，进行激发延迟发光的检测，再进行K值拟合，将全部连翘煎煮液进行相同操作，得到各个产地两种炮制方式所有批次连翘煎煮液的栅藻K值。首先使用SPSS19.0将相同产地和炮制方式的不同批次连翘的K值进行独立样本t检验；其次取山西安泽、河南、陕西商洛三个产地两种炮制方式的连翘煎煮液，并将同一产地清蒸与生晒的连翘煎煮液K值使用SPSS19.0分别进行独立样本t检验；最后将拟合得到的K值分为清蒸和生晒两组，对各组中不同产地连翘煎煮液K值使用SPSS19.0分别进行独立样本t检验。

3.2.1同一产地及炮制方式不同批次连翘煎煮液栅藻K值比较 对相同产地及炮制方式的不同批次连翘煎煮液的栅藻K值进行对比分析，见图1。图1(a)、(b)分别为山西清蒸连翘及山西生晒连翘不同批次K值测定；图1(C)为河南清蒸连翘不同批次K值测定；图1(D)为陕西清蒸连翘不同批次K值测定；图1(E)为山东生晒连翘不同批次K值测定。结果表明，同一产地相同炮制方式的不同批次连翘煎煮液栅藻K值不存在显著性差异。

图1 同一产地及炮制方式不同批次连翘K值比较Fig. 1 Comparison of K values of Forsythia suspensa in different batches of the same origins and processing method

3.2.2不同产地及炮制方式连翘煎煮液栅藻K值比较 图2为相同产地两种炮制方式连翘煎煮液栅藻K值比较，SXAN、HN、SXSL分别代表山西安泽、河南和陕西商洛三个产地，结果表明，相同产地两种炮制方式连翘煎煮液栅藻K值之间均存在显著性差异，且相同产地清蒸连翘煎煮液栅藻K值均高于生晒连翘煎煮液栅藻K值。

图2 同一产地不同炮制方式K值比较(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)Fig.2 Comparison of K values of different processing methods in the same origin(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

不同产地两种炮制方式煎煮液栅藻K值比较，见图3。QZ代表清蒸连翘，SS代表生晒连翘，结果表明，不同产地清蒸和生晒连翘煎煮液栅藻K值比较中，产地间均存在显著性差异。

图3 不同产地不同炮制方式K值比较(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

3.3 连翘煎煮液栅藻K值波动范围

将不同产地两种炮制方式所有批次连翘煎煮液栅藻K值进行统计分析，最终得到连翘煎煮液栅藻K值波动范围，见图4。结果表明，不同产地两种炮制方式连翘煎煮液栅藻K值范围为0.9806～3.8021，主要波动范围为2.05～2.48。

图4 连翘K值波动范围Fig.4 Fluctuation range of forsythia K values

4 讨论

连翘具有抗菌抗炎、抗病毒、神经保护等作用[10-16]。目前，对于中药的研究主要是对中药的主要化学成分及其次生代谢产物进行研究[17-18]，该研究思想主要基于西方医学研究中的还原论，而非基于中药基础理论的整体观念明确中药对生物体整体代谢功能的影响[19]。由于生物光子相干性理论与中医药研究中整体论具有相似特征[6]，因此，将中药药性通过对栅藻激发延迟发光数据处理得到的K值来量化表征药性的方法，符合中医整体观。本研究前期实验结果证明栅藻K值的正常波动范围为2.81～3.89[9]，本实验结果表明，加入连翘煎煮液后的栅藻K值的主要波动范围为2.05～2.48，明显低于空白栅藻K值，可能由于连翘药性为寒性，降低栅藻内部代谢反应，造成加入连翘煎煮液后的栅藻K值降低，这也与中药药性基本理论中的整体观念相吻合。本研究以栅藻作为生物指示剂对不同产地及炮制方式的连翘药性进行评价，结果表明，相同产地和炮制方式的不同批次连翘煎煮液栅藻K值不存在显著性差异；不同产地相同炮制方式连翘煎煮液栅藻K值均存在显著性差异，且清蒸连翘煎煮液栅藻K值高于生晒连翘煎煮液栅藻K值，考虑可能与连翘清蒸与生晒加工中导致主要化学成分含量变化有关。在相同炮制方式不同产地连翘煎煮液栅藻K值比较中，产地之间均存在显著性差异，考虑可能与生长环境不同对连翘质量造成影响。因此本研究中以栅藻作为生物指示剂对不同产地及炮制方式的同一中药进行评价，为中药的质量评价提供了更多依据。但是，栅藻生物指示剂法也仅仅是对于中药药性客观化表述的初步研究，仍然无法完全准确反映中药寒热药性的问题。因此，对于栅藻激发延迟发光测定K值来表征中药寒热药性，仍需大量实验进行验证，同时对中药药材的客观评价方法也需要进一步补充和探索。