耐盐木霉ST02对番茄种子和幼苗盐耐受能力的影响

赵忠娟， 扈进冬, 陈 凯, 魏艳丽， 李纪顺*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)， 山东省科学院生态研究所， 济南 250103； 2.山东省应用微生物重点实验室， 济南 250103)

盐胁迫作为一种非生物胁迫，可以通过诱导植物细胞内的渗透和/或离子失衡来影响作物的生产，使盐渍化土壤成为影响农业生产的主要问题之一。中国是世界上盐渍化最严重的国家之一，盐渍土壤面积超过3 600万hm2，其中耕地盐渍化面积达到920.9万 hm2，占全国耕地面积的6.62%[1]。为了满足人口不断增长导致的大量粮食需求，减弱盐胁迫对农作物的危害，提高农作物耐盐性是值得探讨的问题。

目前，可以通过传统育种方法或先进的分子技术来提高农作物耐盐性，但前者耗时较长，后者成本较高，因此亟待开发一种廉价并快速的促进农作物耐盐技术。近年来，研究发现植物根际微生物群落可以与其宿主之间相互作用，形成一个植物根系-土壤-微生物的相互作用网络，来提高植物对非生物胁迫的耐受能力，包括提高植物耐盐性[2-3]。到目前为止，一些促进植物生长的真菌，如木霉菌，已被证明参与促进植物生长和对盐胁迫的耐受性[4-5]。并且有些研究揭示了木霉菌株促进植物耐盐性的可能机制。例如绿木霉(T.virens)Gv29.8和深绿木霉(T.atroviride)IMI 206040通过增强植物根系发育、渗透物质(L-脯氨酸和抗坏血酸)的生成和Na+消除，促进拟南芥幼苗在盐胁迫下的生长[6]；棘孢木霉(T.asperellum)Q1通过改变植物激素水平和磷酸盐增溶能力，减轻盐胁迫对黄瓜植株生长的抑制作用[7]；长枝木霉(T.longibrachiatum)T6通过增加抗氧化防御及其防御途径中的基因表达来促进小麦的耐盐活性[8]；从大豆根际分离获得的哈茨木霉(T.harzianum)可以通过提高影响抗氧化酶活性、促进渗透物质生成、改善根系活性、增加K+含量和K+/Na+比、降低Na+浓度和乙烯含量等多方面生理生化活性，提高盐胁迫下黄瓜对活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除的能力，以及维持盐胁迫下渗透平衡和代谢稳态，促进黄瓜对盐胁迫的耐受性[4]；牛茄子(Solanumsurattense)的内生木霉-瑞氏木霉(T.reesei)也能改善盐胁迫条件下小麦的营养状况，促进小麦的生长[9]。

研究室致力于从不同生态系统采集的土样中分离具有耐盐活性的木霉菌株，并获得多株具有较高耐盐活性的木霉菌株[10]，从黄河入海口采集的土样中利用耐盐木霉选择培养基筛选获得的一株木霉ST02，对木霉耐盐活性及其促进番茄耐盐机制进行研究，对开发和利用耐盐高效木霉菌株具有较高的理论和生产意义。

1 材料与方法

1.1 木霉菌株与耐盐活性鉴定

耐盐菌株ST02是山东省科学院生态研究所利用耐盐木霉选择培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)+0.4 mol/L NaCl+300 mg/L氯霉素+100 mg/L链霉素+20 mg/L 玫瑰红+0.05% Trton X-100，从东营垦利黄河入海口采集的土样中分离获得的，经形态学和分子鉴定为哈茨木霉。耐盐木霉ST02分离，鉴定以及耐盐活性的鉴定方法参照文献[10]。木霉耐盐率和菌丝干重的相对百分比计算公式为

(1)

式(1)中：wNaCl为耐盐率；rC和rD分别为处理和对照菌落半径。

(2)

式(2)中：wdry为菌丝干重相对百分比；wdC为NaCl处理木霉菌株菌丝干重，g；wdD为对照木霉菌株菌丝干重，g。

1.2 木霉菌株ST02对盐胁迫下番茄种子发芽率和发芽势的影响

木霉菌株ST02在PDA培养基上生长5～7 d，长出大量孢子后，刮取孢子，用灭菌的无菌水重悬，制备木霉孢子悬液。

为确定木霉使用的最适浓度，将灭菌滤纸放入灭菌培养皿中，用0、150 mmol/L NaCl溶液润湿，用稀释到不同浓度0、2×105、2×106、2×107、2×108CFU/mL 的ST02孢子悬液浸泡番茄种子3～4 h，将处理过的种子均匀摆放在润湿的滤纸上，每个皿中60粒，每个处理3个重复，25 ℃ 培养箱中培养，统计种子萌发率，筛选处理番茄种子所需ST02菌株最适孢子悬液浓度。

为研究ST02对盐胁迫条件下番茄种子发芽率、发芽势的影响，将灭菌滤纸放入灭菌培养皿中，用不同浓度的NaCl溶液(0、50、100、150、200 mmol/L)润湿， 用筛选出的最适浓度ST02孢子悬液浸泡番茄种子3～4 h，将处理过的种子均匀摆放在润湿的滤纸上，每个皿中60粒，每个处理3个重复，25 ℃ 培养箱中培养，每天统计种子萌发率，共统计7 d，并测量种子萌发7 d后的根长(root length, RL)和芽长(shoot length, SL)。

1.3 菌株ST02促进盐胁迫下植物幼苗的生长

利用盆栽实验研究木霉菌株ST02对盐胁迫下植物幼苗的生长的影响。从未施加过木霉菌剂的大田中取土，加入纸杯中，每个纸杯中加入土约130 g。播种番茄种子，进行施加木霉处理和NaCl胁迫处理，分别设置对照组。NaCl处理2周后，检测番茄幼苗的存活率、株高、鲜重等。盆栽试验具体设计如下。

1.3.1 木霉施加方法

木霉使用浸种和浇灌两种方式进行施加。

(1)浸种处理。ST02孢子悬液稀释至不同浓度0、2×105、2×106、2×107、2×108CFU/mL，利用不同浓度ST02孢子悬液浸泡番茄种子3～4 h，将处理过的番茄种子播种到准备好的土中，每盆15颗，每个处理6盆，分为两组，分别用于对照和NaCl处理。

(2)浇灌处理。浸种处理播种的同时，平行播种相同数量的未用ST02孢子悬液处理的种子，同样分为对照和NaCl处理两组，用于木霉孢子液浇灌处理。未用ST02孢子悬液处理的番茄种子发芽，长出2个真叶后，往盆中加入15 mL利用稀释至不同浓度2×105、2×106、2×107、2×108CFU/mL的木霉孢子悬液，进行浇灌处理，每个处理6盆，分为两组分别用于对照和NaCl处理。

1.3.2 NaCl胁迫处理方法

木霉处理后，番茄幼苗长至三四片真叶时，用15 mL 200 mmol/L NaCl处理番茄幼苗，2～3 d处理1次，共处理3次，NaCl处理完2周后，测定幼苗的存活率、株高和鲜重。

1.4 菌株ST02促进盐胁迫条件下植物耐盐生理生化反应

利用盆栽实验研究木霉菌株ST02对盐胁迫下植物幼苗的耐盐生理生化的影响。上述盆栽番茄幼苗用NaCl处理2周后，检测番茄幼苗的耐盐生理生化反应，包括叶绿素含量、净光合速率(Pn)、离子渗漏率、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性。

1.4.1 叶绿素含量和Pn测定

分别取不同处理后的番茄幼苗顶端的2片全展的叶片，用便携式LI6400 (LI-COR，美国) 光合速率测定仪测量NaCl胁迫条件下木霉处理和对照番茄叶片的Pn。

取不同处理后的相同部位的番茄叶片，参考张志良等的方法进行叶绿素含量测定，用80%丙酮提取叶片中叶绿素，用分光光度计测定663 nm和645 nm处吸光值[11]。叶绿素含量计算公式为

Ca= 12.7OD663-2.69OD645

3.1.2 膀胱穿孔 膀胱穿孔是TURBT需要特别警惕的并发症，术前应常规进行CT/MRI扫描，了解肿瘤浸润深度和基底大小。电切过深、膀胱过度充盈及闭孔反射是穿孔的主要原因，电切时膀胱灌入液体不能太多，以免膀胱过度膨胀，使膀胱壁变得太薄而容易穿孔；电切侧壁肿瘤时需警惕闭孔反射发生，切除侧壁肿瘤前，可适当加深麻醉予以肌松剂甚至闭孔神经阻滞，适当充盈膀胱，甚至请手术助手适当固定同侧下肢，电切时尽量采取间歇式触发电切模式，均可能降低由于闭孔反射导致的膀胱穿孔发生。此外，术中应仔细辨认结构，一旦切除组织底部见到脂肪组织时，提示已经穿孔，应立即停止这一区域的电切。

(3)

Cb= 22.9OD645-4.68OD663

(4)

Ct= 8.02OD663+20.21OD645

(5)

C=CtVn/m

(6)

式中：Ca、Cb、Ct为叶绿素a、叶录素b、叶绿素总浓度，mg/L；C为叶绿素含量，mg/g叶；V为提取液体积，L；n为稀释倍数；m为叶片鲜重，g。

1.4.2 相对电导率和MDA含量检测

用不同处理的番茄幼苗的叶片为材料，测定NaCl胁迫条件下，用ST02孢子悬液处理和未用木霉孢子悬液处理的番茄幼苗叶片的相对电导率和MDA含量。叶片相对电导率和MDA含量检测参考Lü等[12]的方法。

1.4.3 抗氧化酶活的测定

取0.2 g不同处理的番茄幼苗的叶片，用50 mmol/L预冷磷酸钾缓冲液(pH=7.8)，冰浴条件下研磨成匀浆，倒入10 mL离心管中，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清备用。分别用氮兰四唑(NBT)的光化还原法、愈创木酚法、H2O2测定SOD、POD、CAT的活性[13]。

2 结果与分析

2.1 木霉菌株ST02具有较强耐盐活性

利用含不同NaCl浓度(0、100、250、500、750、1 000 mmol/L)的PDA和马铃薯葡萄糖水(potato dextrose agar，PDW)培养基检测木霉菌株ST02的耐盐活性，结果发现：木霉菌株ST02的生长速度随NaCl浓度的升高减慢，在未添加NaCl的PDA培养基上生长较快，基本覆盖整个培养皿并产生大量孢子；100 mmol/L 和250 mmol/L NaCl对木霉生长影响较小，生长速度较快，但孢子产生受抑制；500 mmol/L NaCl胁迫下，ST02耐盐率达到73.9%；在含1 000 mmol/LNaCl的PDA培养基上，ST02的耐盐率仍可达到27.9%(图1)。木霉菌株ST02的菌丝的干重随NaCl浓度升高也呈降低趋势，低于500 mmol/L NaCl处理时菌丝干重变化不明显，菌丝干重的相对百分比都大于90%，750 mmol/L和1 000 mmol/L NaCl处理时菌丝干重才明显降低，菌丝干重与对照相比，分别是对照的71%和67%，具有较强的耐盐活性(图2)。

图1 木霉菌株ST02对不同浓度NaCl的耐受情况Fig.1 The tolerance of Trichoderma ST02 to NaCl with different concentrations

图2 木霉菌株ST02在含不同浓度NaCl的PDW培养基中菌丝生长情况Fig.2 The mycelial growth of Trichoderma strain ST02 in PDW medium containing different concentrations of NaCl

2.2 木霉菌株ST02促进盐胁迫条件下番茄种子萌发

用不同浓度ST02孢子悬液处理番茄种子的萌发结果显示：未用NaCl处理条件下，番茄种子均具有较高萌发率，不同浓度ST02孢子悬液处理的番茄种子之间无明显差异；150 mmol/L NaCl胁迫条件下，2×107CFU/mL和2×106CFU/mL孢子悬液浸泡的番茄种子萌发率最高，分别为25%和26.7%，比对照增加373.13%和398.51%[图3(a)]，说明处理番茄所用ST02孢子悬液最适浓度为2×106～2×107CFU/mL。

图3 木霉菌株ST02对番茄种子发芽的影响Fig.3 The effect of Trichoderma strain ST02 on seed germination of tomato

选用2×107CFU/mL ST02孢子悬液处理番茄种子，处理的番茄种子在不同浓度NaCl(0、50、100、150、200 mmol/L)胁迫下的发芽情况检测结果显示，200 mmol/L NaCl胁迫下用ST02处理和未处理的番茄种子都难以萌发；在0、50 mmol/L NaCl胁迫条件下， ST02孢子悬液对番茄种子的发芽率没有明显的影响，100 mmol/L和150 mmol/L NaCl胁迫下，菌株ST02显著增加番茄种子萌发率，与未用ST02孢子悬液处理的对照相比，分别增加103.13%和591.18%[图3(b)]。而且，ST02孢子悬液影响番茄种子的发芽势，未加NaCl胁迫的情况下，ST02孢子悬液处理番茄种子发芽势与对照相比差别不大；50 mmol/L胁迫条件下，ST02孢子悬液处理的番茄种子在处理的前3 d发芽率高于对照；100 mmol/L和150 mmol/L NaCl处理条件下，处理的7 d内，ST02孢子悬液处理的番茄种子萌发率一直高于对照，且种子萌发比对照早1～2 d[图3(c)]，说明ST02孢子悬液能够提高盐胁迫条件下番茄种子的发芽率和发芽势。

对发芽7 d的番茄种子的根长和芽长进行测量统计，结果显示：0 mmol/L NaCl条件下，ST02明显增长根长的长度，对芽长影响不明显；50 mmol/L NaCl处理，对照根长与芽长与未加NaCl处理时没有明显差异，ST02孢子悬液处理和未处理的番茄种子相比，根长明显变长，芽长明显变短；100 mmol/L NaCl处理条件下，根长和芽长与未受NaCl胁迫时相比都明显变短，ST02孢子悬液处理明显促进根和芽的伸长；150 mmol/L NaCl处理下，芽未生长，ST02孢子悬液处理明显促进根的伸长；表明木霉ST02促进NaCl胁迫下番茄种子萌发后根和芽的伸长[图3(d)]。

综上结果表明，耐盐木霉ST02菌株能够促进盐胁迫下番茄种子的萌发，且最适的木霉孢子液使用浓度为2×106～2×107CFU/mL。

2.3 木霉菌株ST02促进盐胁迫条件下番茄幼苗生长

利用盆栽实验研究使用不同浓度ST02孢子悬液采用浸种和浇灌两种方式进行处理的番茄幼苗在200 mmol/L NaCl胁迫条件下的生长情况，结果发现：利用2×108CFU/mL的木霉孢子悬液进行浇灌的番茄幼苗生长情况最好，未用NaCl处理时幼苗最强壮，200 mmol/L NaCl处理时存活率最高(图4)。

G105、G106、G107、G108分别为浇灌2×105、2×106、2×107、2×108 CFU/mL的木霉孢子悬液；J105、J106、J107、J108分别为用2×105、2×106、2×107、2×108 CFU/mL的木霉孢子悬液进行浸种处理图4 不同木霉和NaCl处理番茄幼苗生长情况Fig.4 The growth of tomato seedlings under different treatement with Trichoderma and NaCl

对不同处理的幼苗存活率、株高和鲜重进行统计，结果显示，200 mmol/L NaCl 处理下，未用ST02孢子悬液处理的对照组番茄幼苗存活率约为40.83%，除了用2×106CFU/mL孢子悬液浸种的番茄幼苗(与对照组相比没有明显变化)，浸种处理的番茄幼苗存活率比对照组略高；用不同浓度孢子悬液浇灌的番茄幼苗在200 mmol/L NaCl处理下表现出较大差异，2×108CFU/mL的木霉孢子悬液进行浇灌的番茄幼苗存活率达到81.36%，2×105CFU/mL的木霉孢子悬液浇灌的番茄幼苗与浸种番茄幼苗存活率类似，2×106、2×107CFU/mL孢子悬液浇灌存活率比对照组存活率略低(表1)。

株高统计结果显示，未用NaCl胁迫的番茄幼苗，2×107、2×108CFU/mL孢子悬液浸种处理后株高比对照组略高，2×105、2×106CFU/mL孢子悬液浸种处理后株高与对照组没有明显差异，而不同浓度孢子悬液进行浇灌处理后番茄幼苗的株高均明显高于对照组，且2×108CFU/mL孢子悬液浇灌处理时株高最高；200 mmol/L NaCl 处理下，对照组和各处理组的株高都有不同程度的降低，木霉孢子悬液处理的各组株高都高于对照组，其中2×108CFU/mL孢子悬液浇灌处理的番茄幼苗株高最高，NaCl对株高抑制率最小，为4.17%，明显低于对照组的14.72%(表1)。

幼苗单株鲜重结果显示，未用NaCl处理时，用不同浓度ST02木霉孢子悬液处理的番茄幼苗单株鲜重都高于对照组，且浇灌处理的番茄幼苗单株鲜重高于浸种处理，其中2×108CFU/mL孢子悬液浇灌处理的番茄幼苗鲜重最高，比对照组高53.02%；200 mmol/L NaCl处理下，对照组和各处理单株鲜重明显降低，其中2×108CFU/mL孢子悬液浇灌处理单株鲜重最高，与未用NaCl处理的对照相比，2×108CFU/mL浸种和浇灌时单株鲜重降低率相似，分别为7.45%和7.32%(表1)。

表1 不同处理幼苗存活率、株高和鲜重Table 1 The survival rate, plant height and fresh weight of seedlings under different treatments

综上所述，ST02孢子液处理能够促进NaCl胁迫条件下番茄幼苗的生长，幼苗在200 mmol/L NaCl胁迫下的存活率、株高和鲜重高于未用ST02孢子悬液处理番茄幼苗，且2×108CFU/mL木霉孢子悬液浇灌对番茄幼苗的促进效果最优，存活率、株高和单株鲜重最高。

2.4 木霉菌株ST02促进盐胁迫条件下番茄耐盐生理生化反应

利用盆栽实验研究上述不同处理的番茄幼苗耐盐生理生化变化，结果显示：未用NaCl处理时，木霉ST02孢子悬液处理和未用ST02孢子悬液处理的番茄幼苗的叶绿素含量和Pn值没有明显差异；200 mmol/L NaCl处理时，叶绿素含量和Pn值明显下降，木霉ST02孢子悬液处理缓解下降程度，所以ST02孢子悬液处理后番茄幼苗的叶绿素含量和Pn值明显高于对照，且利用2×107～2×108CFU/mL木霉孢子悬液浇灌的番茄幼苗叶绿素含量和Pn值最高(表2)。未用NaCl胁迫的番茄幼苗，木霉ST02孢子悬液处理对离子渗漏率和MDA含量影响较小，200 mmol/L NaCl处理时，番茄幼苗离子渗漏率和MDA含量明显升高，木霉ST02孢子悬液降低升高幅度，用ST02孢子悬液处理的番茄幼苗离子渗漏率和MDA含量明显低于对照，且同样的2×107～2×108CFU/mL木霉孢子悬液浇灌的番茄幼苗效果最佳(表2)。未经NaCl胁迫的番茄幼苗，木霉ST02孢子悬液处理增加番茄幼苗的抗氧化酶活性，200 mmol/LNaCl胁迫降低抗氧化酶活性，木霉ST02孢子悬液处理一定程度缓解NaCl对抗氧化酶活性的抑制作用，使ST02孢子悬液处理的番茄幼苗抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性明显高于对照(表2)。

表2 不同处理幼苗耐盐生理生化指标测定Table 2 The physiological and biochemical characteristic of salt tolerance in seedlings under different treatments

综上结果说明，木霉ST02孢子悬液处理能够促进NaCl胁迫下番茄幼苗的耐盐生理生化反应，通过提高植物抗氧化防御反应活性促进植物耐盐性。

3 讨论

植物根际土壤微生物与植物相互作用，可促进植物对生物和非生物的耐受性，是植物健康生长的重要因素[14]。研究表明大量植物根际微生物群落可以促进植物对盐胁迫的耐受性[15]。木霉菌是土壤和植物根生态系统中常见的一类真菌，研究发现木霉菌能够通过木霉-植物之间的相互关系，诱导植物产生对非生物胁迫的耐受性，目前已有一些关于木霉促进植物耐盐性的研究报告[4-9]，且有研究发现，使用木霉菌肥能够影响土壤中微生物生物量和酶活性，改良盐渍土壤[16]。本研究对收集的耐盐活性高的耐盐木霉，进行木霉对植物耐盐性影响的研究，获得促进盐碱地植物耐盐活性的高效木霉菌株ST02，对开发耐盐碱特性的微生物菌肥具有较高的理论和生产意义。

比较了NaCl胁迫条件下，利用耐盐木霉ST02孢子悬液处理和未用ST02孢子悬液处理的番茄种子萌发、幼苗生长及幼苗耐盐生理生化反应变化，结果显示ST02促进番茄种子萌发和番茄幼苗生长，并影响番茄幼苗耐盐生理生化反应。盐度通过高浓度的Na+的沉积引起渗透势不平衡和离子毒性，致使叶绿体结构破坏，叶绿素含量降低，光合作用的碳同化过程受到抑制[17]。本研究对NaCl胁迫下番茄幼苗叶绿素含量和净光合速率(Pn)进行检测，结果木霉ST02孢子悬液处理的番茄幼苗叶绿素含量和Pn值明显高于对照，说明ST02能够减轻Na+的毒害(表2)。盐胁迫也会导致细胞中活性氧(ROS)的产生，从而使细胞发生氧化损伤。细胞膜中脂质过氧化会产生MDA，影响细胞膜的通透性，离子渗漏率可以指示细胞膜的通透性，因此离子渗漏率和MDA含量反映胁迫条件下细胞膜的氧化损伤[18]。抗氧化酶可以去除细胞中ROS并维持ROS平衡[19]，促进细胞的盐胁迫耐受性。ST02孢子悬液处理的番茄幼苗在NaCl胁迫条件下，离子渗漏率和MDA含量明显低于对照，抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性明显高于对照，说明ST02能够通过提高番茄抗氧化系统防御反应促进番茄的耐盐性。

4 结论

利用耐盐木霉选择培养基从东营垦利黄河入海口土样中筛选获得耐盐木霉ST02,并对其进行耐盐活性鉴定和促进植物耐盐的研究，结果如下。

(1)木霉菌株ST02具有较强的耐盐活性。ST02在含500 mmol/L NaCl 的PDA培养基上生长良好，耐盐率达到73.9%；在含750 mmol/L和1 000 mmol/L NaCl的PDW培养基中菌丝生长量是对照的71%和67%。

(2)木霉ST02促进盐胁迫条件下番茄种子萌发。ST02孢子悬液能够提高盐胁迫条件下番茄种子的发芽率和发芽势，100 mmol/L和150 mmol/L NaCl胁迫下，菌株ST02使番茄种子萌发率分别增加103.13%和591.18%，且种子萌发比对照早1～2 d；ST02还促进NaCl胁迫下番茄种子萌发后根和芽的伸长，且处理番茄种子所用ST02孢子悬液最适浓度为2×106～2×107CFU/mL。

(3)木霉ST02促进盐胁迫条件下番茄幼苗生长。ST02孢子液处理的番茄幼苗在200 mmol/L NaCl胁迫下的存活率、株高和鲜重均高于未用ST02孢子液处理番茄幼苗，且2×108CFU/mL木霉孢子悬液浇灌对番茄幼苗的促进效果最优，存活率、株高和单株鲜重最高。

(4)木霉ST02促进NaCl胁迫下番茄幼苗的耐盐生理生化反应。200 mmol/LNaCl处理时，木霉ST02孢子悬液处理后番茄幼苗的叶绿素含量和Pn明显高于对照， 离子渗漏率和MDA含量明显低于对照，抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性明显高于对照。