棉田复种芥菜对土壤中大丽轮枝菌和黄萎病的影响

柳瑞冰，岳弘辰，冯自力，冯鸿杰，赵丽红，张亚林，魏锋，朱荷琴

（棉花生物学国家重点实验室/ 中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455000）

由土传病原真菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.） 引致的棉花黄萎病目前已经成为棉花生产中最具威胁的病害，对棉花产量和纤维品质构成严重影响[1]。 由于棉花黄萎病具有土传，病原菌寄主范围广、变异快、在土壤中存活时间长、侵染过程复杂，抗性种质资源缺乏，发病高峰主要出现在作物生长的中后期等特点，其一旦发生，经常造成巨大损失[2]。

作物土传病害发生的严重程度很大程度上取决于土壤尤其是根际土壤中病原菌的数量[3-4]。间套作植物根分泌物中的化感物质可能对病原菌的生长和繁殖有抑制作用，因而能达到防治病害的直接效果[5-8]。 同时，间套作还可通过以下方式增强防病效果：一是促进作物对养分的吸收利用，改善寄主作物的生理生化特性， 进而提高寄主作物的抗病性；二是增加地上部作物多样性和地下部根系分泌物的多样性，改变田间小气候及土壤微生态环境[9]。

国外对绿肥防治黄萎病已经进行了大量研究，发现荞麦 （Fagopyrum esculentum Moench）、 油菜（Brassica campestris L.） 等作为绿肥能够有效防治黄萎病[10]。 近年来国内也有研究人员发现在棉田使用油菜绿肥和套作芥菜（Brassica juncea）对棉花黄萎病有明显的防治效果[11-13]。但是，通过采用复种非寄主植物的模式控制棉花黄萎病相关的研究却少有报道。

本研究以棉花复种芥菜模式为例，通过监测棉田土壤中大丽轮枝菌微菌核季节性消长规律和棉花黄萎病发生程度，揭示该复种模式对病原菌的影响以及对棉花黄萎病的防治效果，为建立合理种植模式防治棉花黄萎病提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大丽轮枝菌选择性培养基为改良的土壤浸出液琼脂培养基 （Modified soil extract agar，MSEA），配方：2 g 硝酸钠，1 g 磷酸二氢钾，0.5 g 七水合硫酸镁，0.5 g 氯化钾，0.01 g 七水合硫酸亚铁，2 g 多聚半乳糖醛酸，1 mL 壬基酚聚氧乙烯醚NP10（Sigma，英国），15 g 琼脂（Fluka，英国），用蒸馏水定容至1 L。 添加琼脂前用配好的1 mol·L－1KOH 溶液调pH 至6.4。 高压灭菌后将培养基冷却到55 ℃左右时添加10%（体积分数） 过滤除菌的抗生素混合液（每10 mL 混合液含有链霉素、氯霉素、金霉素各6 mg 和0.6 mg 维生素H）[13]。 供试棉花品种为耐病品种鲁棉研21。 供试芥菜品种为特选大坪埔大肉包心大芥菜（产品进口商：广东省金作农业科技有限公司）。

1.2 试验设计

2018 年开展试验， 设棉花单作和复种芥菜2个处理， 每个处理7 个重复， 共14 个小区随机排列。 棉田复种芥菜种植模式：在3 月棉田土壤墒情较好时，将芥菜种子撒播于棉田，播种量为每公顷15 kg，棉花播种前将芥菜直接翻压还田。 小区面积为25 m2， 棉花单作小区和芥菜复种小区同时于4月底播种棉花，行距80 cm，株距25 cm，小区之间采用防水隔板进行隔离防止土壤微生物相互污染。试验小区内棉花的种植管理与常规棉田相同，田间环境条件下自然发病，试验过程中不使用病害防治措施。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤样品采集。供试土壤采集自中国农业科学院棉花研究所人工接菌棉花黄萎病抗病鉴定病圃（河南安阳）。此病圃每年用于国家和省级棉花品种区域试验抗病性鉴定，种植不同棉花品种。 病圃于2010 年和2015 年分别人工接种大丽轮枝菌Vd076 菌株（分离自河南安阳发病棉花植株，中等致病力）繁殖体。 分别于2018 年3 月3 日、6 月28日和8 月2 日采样，采样时将病圃每个病池（10 m×10 m）去除边缘1 m 区域后，每个小区（5.0 m×5.0 m）划分9 个约1.7 m×1.7 m 的微区， 每个微区取1个土芯， 将每个小区提取的9 个土芯混合为1 个土样。

1.3.2 土壤中大丽轮枝菌微菌核定量检测。先将土壤样品在室内温度下自然晾晒3 周以杀死其中的大丽轮枝菌孢子和菌丝， 然后过孔径2 mm 的筛网。参照Wei 等[13]报道的水筛平板法测定土壤中大丽轮枝菌微菌核数量，具体过程如下：

（1）称取10 g 土样于200 mL 三角瓶中并用无菌水定容至100 mL， 置于回旋式摇床（HS501，IKA，USA）， 在转速170 r·min－1下震荡1 h 左右混匀， 然后在细水流下将土壤混合液过孔径20 μm的细筛，待过筛的水流清澈后将筛网上的残留物全部收集到试管中并定容至20 mL（每次筛土前将筛子洗干净，并在水中煮沸，保证筛子上无残留的活微菌核）。

（2）在超净工作台中将收集好的20 mL 土样混合液均匀涂布在10 个含有MSEA 培养基的培养皿表面，并在无菌条件下风干1～2 h，用封口膜封口后于22 ℃暗培养箱中培养4 周。

（3）培养完成后将培养皿拆封并将表面土壤在小水流下慢慢冲洗干净，自然晾干。 在洗干净的培养皿底部沿横向划1 条直线， 纵向每隔1 cm 划1条直线，将培养皿分隔成18 个区域。将培养皿倒置在24 倍体式显微镜（SMZ-10 Nikon，Japan）下观察并记录菌落数量。

1.3.3 棉花黄萎病病情调查。 在棉花生长季节内，分别在6 月底和8 月底调查棉花黄萎病， 按表1 标准进行分级，并计算发病率、病情指数及防治效果[14]。

表1 棉花黄萎病病情分级标准

2 结果与分析

2.1 土壤中V.dahliae 微菌核分布

本试验地为人工接菌病圃，棉花黄萎病发生均匀。 对试验地42 个土样检测发现， 土壤中V.dahliae 微菌核呈不均匀分布，61.9%的土样中小于10 g－1；仅有2 个土样的大于20 g－1，占4.8%（图1）。

图1 土壤中大丽轮枝菌微菌核的分布

2.2 复种芥菜对V.dahliae 微菌核密度的影响

病圃中棉花单作区土样微菌核数量在3 月3日（芥菜播种期）密度最高，随着生育期的推进，土壤中微菌核密度有下降趋势，8 月份土壤中微菌核密度最低（图2）。

图2 病圃土壤中微菌核的季节性变化

复种芥菜小区与棉花单作（对照）小区相比，芥菜播种期V. dahliae 微菌核密度不存在显著性差异；6 月28 日调查中， 复种芥菜的小区V.dahliae微菌核密度比对照下降14.6%；8 月2 日调查中，复种芥菜小区V. dahliae 微菌核密度比对照下降47.63%，达到差异显著性水平（P＜0.05）。复种芥菜作为绿肥的小区中大丽轮枝菌微菌核密度在棉花生长中后期明显下降，表明该模式对大丽轮枝菌微菌核存活有较好的抑制作用（图3）。

图3 复种芥菜与棉花单作土壤微菌核数量的比较

2.3 对棉花黄萎病的防治效果

不同生长季棉花黄萎病病害调查结果显示，8月2 日复种芥菜小区的病情指数（23.5）显著低于棉花单作小区的（29.2），6 月28 日和8 月2 日的防治效果分别为42.4%和19.6%（表2）， 初步认为复种芥菜作为绿肥对减轻棉花黄萎病有较好的作用。

表2 复种芥菜作为绿肥对棉花黄萎病的防治效果

3 讨论与结论

大量使用化学农药进行土壤熏蒸，虽然可以减轻棉花黄萎病的发生，但容易引起环境污染，因此目前常用的化学土壤熏蒸剂（例如溴甲烷）在农业生产中已经被禁用。土传病害防治领域的研究热点一直是利用生物有机肥、间套作、轮作等农业措施调控以形成抑病型土壤[15]。 合理间套作作为防治土传病害经济有效的措施之一，在抑制植物病害流行方面起重要作用[8]。

本研究通过对3 月、6 月及8 月3 次所取土样中V.dahliae 微菌核数量的检测， 发现3 月土壤中微菌核密度最高， 随着生育期的推进， 土壤中V.dahliae 微菌核密度有下降趋势， 且8 月份土壤中最低。 这可能是由于V.dahliae 繁殖、传播和死亡，以及微菌核主要在春季或者夏季释放到土壤中，造成土壤中其群体数量的周期性变化。 这与前人[16]研究结果一致。Koroleva 等也发现土壤中微菌核密度在播种期时最高，随着作物生育期的推进而逐渐下降，作物收获后开始逐渐上升[17]。 还有研究也证实花椰菜（Brassica oleracea L.var.botrytis L.）田土壤中的Verticillium tricorpus 微菌核在春季、 夏季达到高峰，秋季下降，9 月和10 月为全年最低[18]。有可能是花椰菜病残体主要在春夏季将微菌核释放到土壤中，因为在某些寄主植物死亡后并不伴随微菌核的形成，而是在下雨或灌溉提供湿润环境后才能形成微菌核[19]。

本研究尽管只有1 个生长季节数据，但是在整个试验期间复种芥菜处理的7 个重复小区土壤中V.dahliae 微菌核数量均少于棉花单作处理， 且两者微菌核数量和病情指数在8 月份均存在显著性差异，初步认为复种芥菜能有效抑制棉花黄萎病的发生和土壤中棉花黄萎病菌数量。但不同年份时是否仍有类似的显著效果需要进一步研究验证。

已有研究表明复种植物产生刺激代谢物质抑制土壤中病原菌是套作抑制病害发生的机制之一[20]。据报道，十字花科芸薹属植物可产生132 种不同硫代葡萄糖苷，可以被植物组织腐烂过程中产生的芥子油苷水解，产生具有强杀生活性且易于挥发的异硫氰酸酯[19]。 此外，土壤微生物种类和数量的多少也与病害发生程度、土壤肥力等密切相关。 有报道表明，种植翻压绿肥后，耕层土壤微生物（土壤真菌、细菌、放线菌）数量均大幅度增加[11]。 可见，复种绿肥翻压还田在降低棉花黄萎病发生、提高土壤肥力方面有重要应用价值。

在目前既要保障农业生态安全，又缺乏黄萎病抗性优良棉花品种的情况下，复种芥菜作为绿肥或将是有效控制棉花黄萎病的农业措施之一，有助于棉花节本增效。