稀有人参皂苷微生物转化研究进展

章沙沙，张海玲，叶静，徐健峰※

(1.盘锦检验检测中心，辽宁 盘锦 124010；2.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112)

人参作为我国一种传统的中药已使用了2 000 多年，被誉为“百草之王”，由于其独特的药理活性而在世界范围内广泛使用[1,2]。我国是人参种植大国，但我国人参产品品种十分有限，产品优势明显落后于日韩等国家。人参皂苷是人参中的主要活性物质，具有独特的生物学活性和药用价值。人参皂苷的生物活性包括抗癌[3,4]、抗老化、抗炎[5]、抗过敏[6]、抗糖尿病[7]、抗高血脂[8]、抗疲劳和抗氧化活性[9]，并且还可以促进DNA、RNA和蛋白质的合成。人参皂苷作为人参质量评估的关键指标，在不同人参中的分布有所不同。目前，从人参或三七等中药中分离并鉴定出的人参皂苷有100 余种，其中人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf 和Rg1 占总人参皂苷的90%以上，通常被认为是主要的人参皂苷[10,11]。研究发现，人参皂苷经过转化后的次级代谢产物具有更强的生物活性，这种次级代谢产物称之为稀有人参皂苷[12]。稀有人参皂苷F1、F2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3、CY、CM 和CK 在人参中的含量极少，人体胃肠道对主要人参皂苷的吸收非常差，而稀有人参皂苷更容易被人体吸收并发挥作用。现已证明稀有人参皂苷具有更好的药理活性，是癌症治疗的潜在候选药物[13]。目前，从人参等中药中提取的稀有人参皂苷产量低，不能满足市场需求，限制了其开发和应用，因此，通过转化主要人参皂苷来制备稀有人参皂苷具有非常重要的意义。人参皂苷可以通过酸水解、碱水解、微生物法和酶解法转化成为具有药物活性的稀有人参皂苷[14-16]。在这些方法中，由于微生物转化法具有高特异性和高产率，被认为是制备稀有人参皂苷的最有效途径之一[17-19]。

微生物转化法是利用微生物细胞分解释放一种或多种酶，定向水解人参皂苷从而获得稀有人参皂苷的过程。微生物转化过程中会产生各种酶，包括 -葡萄糖苷酶、-半乳糖苷酶和 -阿拉伯呋喃糖苷酶，这些酶可通过在C-3，C-6 和C-20 处切开糖基部分来转化人参皂苷[7]。微生物转化法具有物理或化学方法难以实现的优点，相较与其他转化方法生产成本低、周期短、副产物少，而且产物更安全。近年来，关于微生物转化稀有人参皂苷的研究已取得了一些显著的研究成果[20-22]。本文综述了不同微生物转化稀有人参皂苷的最新研究进展，为研究稀有人参皂苷的制备提供参考依据。表1 为近年来将人参皂苷转化为稀有人参皂苷的微生物种类、反应条件及生成产物等情况。

表1 微生物转化稀有人参皂苷Table 1 Ginsenosides transformation by hydrolyzing in ginsenosides using microbial

1 食用微生物转化稀有人参皂苷

随着人们对食品安全重视程度的不断加强，从食品中分离出的微生物在工业生产中应用前景越发广阔。目前大多数用于人参皂苷转化的微生物对于食品消费和药物开发可能并不安全。为了将微生物转化产生的人参皂苷安全地应用于食品，需要使用食品级的微生物。食品微生物对Rb1 和Re 的转化途径如下：Rb1→Rd 和F→CK，Rb1→Rd 和F2→Rh2，Rb1→Rd→F2，Re→Rg2→Rh1，Re→Rg1→Rh1。人参皂苷Rb2 和Rc 同样可以被食物微生物转化。Rb2 和Rc 的转化途径如下：Rb2 和Rc→Rd→F2→Rh2 或CK，Rb2→CO→CY→CK，Rc→MC→CK[23]。表2 为人参皂苷转化为稀有人参皂苷的常见食品微生物种类。

表2 常见转化为稀有人参皂苷的食品微生物种类Table 2 The common food microorganisms transformed into rare ginsenosides

稀有人参皂苷CK（Compound K）是营养补品、化妆品和传统药物中必不可少的成分，具有抗动脉硬化、抗癌和保护神经等多种生物活性[24,25]。韩国在人参皂苷转化方面的研究工作居世界领先地位，Yoo J M[26]利用从泡菜中分离出来的短乳杆菌FR-B 发酵人参细根，经5 d 发酵后产生大量的稀有人参皂苷CK，由此表明短乳杆菌FR-B 是较好的微生物转化用食用菌。Palaniyandi等[27]使用人参粗提物筛选出副干酪乳杆菌MJM60396，将Rb1 与MJM60396 一起温育，可转化生成Rg3 和Rh2。菌株MJM60396 有潜力作为保健食品用于制备Rg3 和Rh2。韩国泡菜世界研究所研究员Park B 等[28]从泡菜中分离出的5 株乳酸菌（明串珠菌WiKim19、戊糖片球菌WiKim20、短乳杆菌WiKim17、乳明串珠菌WiKim48 和樱乳杆菌WiKim49）可将Rb1转化为Rg3。实验结果表明，微生物转化人参皂苷与酶活性和环境条件如有机酸的产生有关。稀有人参皂苷的抗氧化活性和抗炎作用可增强皮肤的抗衰老作用[29]。Bak M J 等[30]利用酿酒酵母发酵黑人参FBG，发现FBG 具有多种生物活性，包含人参总皂苷1.440g/mL、Rg2 2.86g/mL、Rg3 24.52g/mL、Rh1 12.64g/mL、Rh2 0.63g/mL 和Rf 1.32g/mL。Park E S 等[31]利用FBG 发酵生成的产物作用于人皮肤成纤维细胞HS68，结果证实FBG 具有潜在的抗氧化活性，可作为化妆品抗皱的有效成分。Cui C 等[32]利用食品级GRAS 菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032 表达重组-葡萄糖苷酶MT619，同时使用纤维素作为固定材料，以提高CK和F1 的生产效率。Liu Z 等[33]通过高效液相色谱-电喷雾电离质谱分析筛选了24 种可食用和药用蘑菇的微生物，可将PPD 型人参皂甙（Rb1、Rc、Rb2 和Rd）转化为稀有人参皂甙（F2、CO、CY、CMc1、CMc 和CK）的强大能力，这是食用和药用蘑菇发酵将主要人参皂苷生物转化为稀有人参皂苷的第一个报道，同时也证明了食用蘑菇是获得稀有人参皂苷的潜在食品微生物。

2 肠道细菌转化稀有人参皂苷

人和动物的肠道细菌包括拟杆菌、（短）双歧杆菌、梭形杆菌属、德氏乳杆菌和明串珠菌等，因其在人参皂苷转化中的潜力而备受关注。由于肠道细菌可以代谢经口摄入的人参皂苷，因此可以安全地用于多种食品和药品中。许多研究人员研究了肠道菌群体内人参皂苷的代谢，Niu T 等[34]研究了肠道微生物中细菌将红参提取物中的人参皂甙转化稀有人参皂甙的能力。他们利用小鼠肺癌LM1 细胞测试了稀有人参皂甙的抗增殖活性，结果发现A/J 小鼠在口服Rb1 后血液中产生大量稀有人参皂苷F2 和CK，且CK 的抗增殖活性和通透性高于其他人参皂苷，由于哺乳动物细胞不水解人参皂苷，因此可以确定是肠道中的细菌水解了人参皂苷，并发现Rb1 逐步水解为Rd，Rd形成F2 是Rb1向CK 生物转化的过程。Shan Y 等[35]从人粪便中克隆了BlBG3，一种来自长双歧杆菌的GH3 -葡萄糖苷酶。并发现BlBG3 比其他微生物-葡萄糖苷酶以更高的效率催化糖苷呋喃甾醇和Rb1 的水解。与D-葡萄糖复合的BlBG3 的结构分析显示了其3 个独特的环，形成了一个深口袋并参与底物结合，为人参皂苷用于医药和食品工业提供理论基础。Jung I H[36]测定了148 份人粪便样品中Rb1 的代谢活性，并从一株长双歧杆菌H-1 中克隆了编码 -D-葡萄糖苷酶（BglX）的基因，能将Rb1 转化为CK，这一研究结果为新型抗肿瘤药物的研究和开发提供有用的信息。Shen H等[37]通过健康人的肠道细菌样品进行厌氧孵育来研究肠道细菌产生的代谢产物和模拟胃液内环境分析Rb1 的降解过程，研究发现，Rb1会产生5 种代谢产物，即Rd、F2、CK、绞股蓝皂苷XVII和绞股蓝皂苷LXXV。Rb1 对酸高度不稳定，并迅速降解形成F2、Rg3、Rh2 和CK，但在模拟胃液中未生成绞股蓝皂苷。绞股蓝总皂甙的形成可能是由于肠道细菌介导的酶促参与。本实验室从反刍动物的血液、肠道和粪便等组织中分离出5 株纤维素酶活较高的细菌，经鉴定为纤维微细菌属（Cellulosimicrobium sp.），通过薄层层析和高效液相色谱分析发现，5 株菌具有很高的人参皂苷转化活性，前期实验结果显示可将Rb1转化为Rd、GypXVII、F2、Rg3、Rh2和CK[38]。

3 内生菌转化稀有人参皂苷

内生菌是指在生活史的某一阶段或全部阶段生活在健康植物的各种器官或组织内部的微生物，包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌[39]。Lei C等[40]从桔梗中分离出69 种内生菌，其中有32 种产生-葡萄糖苷酶的内生菌，内生菌藤黄色杆菌JG09 能有效地转化人参皂苷为稀有人参皂苷。例如，JG09 可以将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc 和Rd 转化为人参皂苷F2 和CK，并将Rg1 转化为Rh1。转化人参皂苷F2 和CK 的最高生产率分别达到94.53%和66.34%。实验表明JG09 是获得稀有人参皂苷CK 和F2 潜在的微生物来源。Nan W等[41]从植物中分离出酿酒酵母WLT-MVA5，通过诱导表达“人参”基因PGM2、UGP1 和UGT1WLT-MVA5，经酶催化将原人参二醇合成CK的转化率达到64.23%，同时添加甘油优化发酵条件，使得CK 产量增加到384.52 mg/L。稀有人参皂苷Rg3 和Rh2 具有较好的药理活性和市场需求，已引起了越来越多学者的关注[42]。Fu Y 等[43]从人参中分离出10 种产生 -葡萄糖苷酶的内生细菌，其中内生细菌洋葱伯克霍尔德菌GE17-7具有较高的水解活性，可将Rb1 和Rd 转化为稀有人参皂苷Rg3。GE17-7 代谢转化途径为Rb1→Rd→Rg3。最佳培养条件为pH 7.0、30°C 发酵15 h，Rg3 的最大转化率为98%。将GE 17-7 应用于新药开发中用于制备人参皂苷Rg3 具有广阔前景。两年后Fu Y[44]又分离得到内生细菌黄杆菌GE32，可将Rb1 转化为Gyp-XVII 和Rg3，GE32 在制药工业制备Rg3 中同样具有潜力。韩国学者Yan H 等[45]从人参根组织中分离提取出81 种内生细菌，其中农杆菌PDA-2 生产稀有人参皂Rg3 和Rh2 的含量分别达到62.20 和18.60 mg/L。尽管大多数真菌在人参皂苷的生物转化中不能与土壤细菌和肠道菌群媲美，但冬虫夏草作为一种珍贵的药用真菌在人参皂苷的生物转化中具有很好的转化效果。Wang WN 等[46]通过高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱发现了冬虫夏草的生物转化途径Rb1→Rd→F2→CK。冬虫夏草转化Rb1为CK的转化率超过82%，制备的CK 纯度超过91%。

4 土壤微生物转化

从土壤中分离出的微生物包括真菌和细菌。真菌如蓝色犁头霉、直立顶孢霉、新月弯孢菌、镰刀菌、根霉菌和拟青霉属等；细菌如巨大芽孢杆菌、伯克霍尔德菌，间孢囊菌属、微杆菌属和鞘氨醇单胞菌等也已用于人参皂苷的转化。土壤微生物因其在廉价的培养基中生长更快，因此比肠道细菌转化人参皂苷更加经济实在，但由于某些土壤真菌具有毒素，因此只有土壤微生物被认定为是安全的情况下，才能将其应用于食品或药品工业中。Lin F等[47]从人参中分离出产生-葡萄糖苷酶的杂色曲霉菌株LFJ1403。LFJ1403通过水解C-20位的外部葡萄糖部分将Rb1 转化为Rd。最佳生物转化条件为37°C，pH5.0 和48 h，转化率最高可达96%，工业化扩大实验转化率可达85%。杨淑钦等[48]选用纤维素降解菌PSW 和厌氧嗜热纤维素分解细菌HCp，对人参皂苷进行转化。通过薄层色谱和高效液相色谱检测，发现并证实这2 株厌氧菌可以转化产生CK。Cui C H 等[49]从人参栽培土壤细菌中分离了一株有效转化绞股蓝皂苷XVII 为LXXV 的微杆菌属Gsoil 167，并研究了其对3 种癌细胞系（HeLa，B16 和MDAMB231）的体外抗癌作用，结果表明，绞股蓝皂苷LXXV显著降低了细胞活力，显示出较强的抗癌作用。Li F 等[50]获得了一种新型真菌突变体黑曲霉菌株TH-10a，TH-10a 可以有效地将Rb1 转化Rd。通过高效液相色谱分析鉴定Rb1 的C20 位置去除外部葡萄糖残基而生成的Rd。最佳培养条件为28℃、pH6 和48 h，获得最高的转化率86%。在最佳条件下处理72 h 后，TH-10a 可以耐受40 mg/mL 人参根提取物作为底物，生物转化率达到60%。实验表明，TH-10a作为一种新的人参皂苷Rd 转化真菌，在制药工业中具有潜在的实际应用。

5 结语与展望

2000 年我国批准稀有人参皂苷Rg3 为处方药；2006年我国研发的稀有人参皂苷Rh2药品批准上市[12]。由于在中药中稀有人参皂苷含量极低，并且我国目前缺乏批量生产稀有人参皂苷的专业技术，使得稀有人参皂苷研究仅限于基础科研，限制了其在制药和食品工业中的应用[51]。物理和化学方法都不适用于工业化大规模生产人参皂苷，如酸水解法虽然能够生产稀有人参皂苷，但反应过程剧烈，且稀有人参皂苷转化率并不高。碱水解法获得稀有人参皂苷对pH、压力和温度等条件要求非常苛刻，而微生物转化在人参皂苷的转化中具有明显优势。微生物转化法获得稀有人参皂苷具有快速、方便、有效和无害化等优点，因此成为转化稀有人参皂苷最常用的方法。未来抢先具备产业化生产稀有人参皂苷的企业必将具有市场话语权。随着科技的发展，通过设计组合微生物或几种加工方法联合使用转化单体人参皂苷增加稀有人参皂苷的含量，对提高人参产品的食用和药用价值具有重要意义。