半夏叶片开放式组培体系初步建立

李欣，赵振军，张建，郭丽红，王迪，武彦芳

（1.长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025；2.宜宾学院川茶学院，四川 宜宾 644000）

半夏[Pinellia ternate (Thunb.) Breit]为大宗药材，市场需求量大，人工栽培过程中存在繁殖系数较低、退化减产且优质种减少、病毒感染以及栽培技术不高等问题，导致半夏产量不能满足需求。其中无性繁殖的自繁留种更易导致带病材料的累积，使后期病虫害暴发，影响半夏的品质和产量，制约半夏产业的进一步发展。组织培养是快速增殖种苗的有效方式，再生植物具有发生数量多、培养周期短、结构完整、成苗率高以及遗传背景一致的特点。很多学者开展过半夏的组织培养相关工作，并取得丰硕成果，建立了半夏完整的快繁体系[1-3]。传统组培需要严格的无菌环境，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照及湿度等培养条件，组培苗的成本相对较高，难以满足栽培的需求，而开放式组培较传统组培脱离无菌的环境，通过抑菌素的添加达到抑制病原菌的增殖，从而避免培养基污染，达到省时省力、提高效益的目的。我国开放式组培在香蕉[4]、切花菊‘白扇’[5]、马铃薯[6]、山丹丹[7]、蓝莓[8]、相思[9]和甘蔗[10]等植物上取得一定成功，初步建立了开放体系。日本在多种观赏植物中已经广泛应用开放式组培，并取得很大进展[11]。

因此，本研究在前人研究的基础上，以半夏叶片为材料，研究半夏开放式组培技术，以进一步降低生产成本，建立高效再生的半夏开放组培体系，满足市场对种苗的需求。

1 材料和方法

1.1 材料

以长江大学西校区栽培的桃叶型半夏为材料，取叶片为外植体，进行半夏开放式组培的相关研究。

1.2 方法

1.2.1 开放式培养基的配置 用抗生素（头孢克肟、链霉素）、抗菌剂（多菌灵、代森锰锌）以及次氯酸钠的不同浓度组合物作为抑菌剂，对培养基的质量进行观察，放置15 d 后，统计污染率和外植体生长状态。

1.2.2 外植体消毒方法 取半夏叶片，采用次氯酸钠、酒精以及升汞消毒的组合，每个处理接种50 个外植体，1 周后统计叶片外植体的污染情况。

1.2.3 不同激素种类和浓度对半夏叶片组培效果的研究 在1.2.1 和1.2.2 最佳处理的基础上，设计不同的TDZ浓度组合，MS+6-BA1.0+NAA0.2（CK）以及在对照中添加浓度为0.05、0.1、0.3 mg/L的TDZ，观察叶片外植体愈伤组织诱导以及分化情况。

2 结果与分析

2.1 不同抑菌剂组合对培养基效果的影响

不同抑菌组合对培养基效果的影响，见表1。

表1 不同抑菌剂组合对培养基效果的影响Table 1 Effects of different antibacterial combinations on the effect of the culture base

通过表1 可知，除7 号组合以外，其他组合均可达到控制培养基污染的效果，但接种外植体后污染率都有所上升，其中以2 号和3 号组合上升最明显。1 号抑菌剂的使用浓度提高，虽然可以更好地控制培养基污染，但对外植体愈伤组织的产生和增殖的影响也相对提高。一旦外植体生理情况变差就极易导致半夏内生菌的增殖，导致整个外植体受到污染。根据比较分析，设计组合中5 号和6 号的效果比较好，所用的抑菌剂浓度可以抑制培养基中的病原物，对外植体的影响也较小，但其中6 号外植体的愈伤组织增殖比5 号要快。因此，综合考虑，培养基处理以6 号为宜。

2.2 不同外植体消毒方法对污染的影响

不同外植体消毒方法对污染的影响，见表2。

表2 不同外植体消毒方法对外植体污染的影响Table 2 Effects of different external plant disinfection methods on external plant contamination

通过表2 的结果分析，升汞的消毒效果较好，污染率较低，但随着升汞处理时间的延长，外植体的死亡率也逐渐加大。升汞有毒，容易造成环境污染，若无菌水冲洗不彻底，会造成外植体中毒死亡。次氯酸钠处理时间延长会造成外植体死亡率的上升，但时间短，消毒效果又不理想。单独使用酒精时，先用酒精润湿的纱布反复擦洗干净，再用酒精浸泡搅拌45 s，污染率控制在30%左右。综合分析，采用方法5 最好，虽然污染率高，但外植体的死亡率最低，且操作比较简单，对环境影响也较小，发现污染，及时去除，并不影响组培瓶中其它外植体的继续发育。

2.3 不同激素浓度对半夏组培效果的影响

不同激素浓度对半夏组培效果的影响，见表3。

表3 TDZ 浓度对半夏组织培养的影响Table 3 Effect of TDZ Concentration on Tissue Culture of Finellia ternate

激素浓度在半夏愈伤组织诱导和分化中起着重要作用，在没有添加激素TDZ 的组合中，6-BA 和NAA诱导出大量的愈伤组织，但不能进行分化，需要转接到分化培养基中进行分化。添加TDZ 处理的组合，不需要进行分化转接，可直接从愈伤组织上分化出丛生芽。TDZ浓度对分化的效果有不同的影响，低浓度的TDZ有明显的促进作用，可直接在愈伤组织上分化出芽，不需要转接分化；较高浓度的TDZ 会产生一定的抑制作用，导致愈伤组织出现褐化，从而影响丛生芽的质量。

图1 半夏开放式组培的效果Fig.1 Effect of open tissue culture of Finellia ternate

在各处理中，半夏叶片的开放式组培中的形态发生过程基本相似，叶片切口处产生愈伤组织，其中叶脉中的形成层最为活跃，最先产生愈伤组织并迅速增殖，其他部位产生愈伤组织较慢且增殖较慢（图1-1），18 d左右，愈伤组织体积明显增大，质地紧密，白色（图1-2）；1 个月左右，愈伤组织产生较多圆状凸起，该结构类似珠芽的作用（图1-3）且数量较多；45 d 左右，圆状凸起变为绿色，分化出芽（图1-4），之后丛生芽快速生长，产生大量丛生芽，并不断有新的芽点产生（图1-5）；之后，转入生根培养基中进行培养，可产生不定根（图1-6），不定根的数量与愈伤组织的体积呈正相关；在椰土中进行炼苗移栽，生长良好，由于愈伤组织不断分化出芽，因此，丛生苗的特征较为明显（图1-7）。在培养过程中，由于培养条件的恶化，如高湿、缺氧，导致丛生芽生理状态较差（图1-8），难以进一步增殖或分化，采用蛭石无糖培养，部分组培苗在老叶、叶柄枯萎后，可重新萌发出新叶，并产生根系，形成功能正常、形态正常的组培苗，降低污染造成的损失（图1-9）。

3 讨论

3.1 抑菌剂的选择

叶片的消毒处理仍然存在一些问题，如叶片存在一定污染率，主要是细菌污染，真菌污染控制较好。在抗生素的选择方面，还需要进一步的筛选。由于细菌种类较多，单一的抗生素很难起到较为满意的效果。在抑菌剂方面，前人做过较多的研究，并取得了较大的进展。卢加举等[12,13]对复合抑菌剂进行了研究，并取得预期的抑菌效果。此外，部分植物精油含有杀菌、抗菌活性物质，在抑菌剂方面有广阔的应用前景[14,15]，在避免抗生素的使用及降低成本方面具有一定的应用潜力。抑菌剂对无菌苗的生长有一定抑制[16]，但抑菌机理的相关研究尚不完善。

3.2 消毒方法

在外植体转接过程中，由于外植体经过酒精消毒，在转接过程中，酒精可能未挥发完全，导致酒精持续对外植体叶片造成损伤，致使叶片生理状态变差，从而导致死亡。待酒精挥发完全，可降低转接的死亡率。在超净工作台操作，风速可加快酒精的挥发，从而降低酒精对外植体的伤害。从污染情况来看，外植体消毒和接种应在超净工作台上进行，这样可以避免外植体的感染，待外植体产生愈伤组织进行增殖时，可以在室内进行，这样污染率非常低，和在超净工作台上进行无显著性差异。

3.3 开放培养的效果

开放培养由于没有高压灭菌的过程，因此营养物质的损耗以及激素损耗较少，使开放培养基中的激素浓度有所降低，同时琼脂使用量大大降低，由7 g/L降低为3 g/L，木薯粉的添加使培养基的配制不需要pH的调整，大大缩短配制时间。与传统无菌培养的半夏相比较，开放式组培中激素浓度需要相应降低，愈伤组织的增殖以及丛生芽的诱导较传统组培差距不大，表明抑菌剂的种类和浓度对半夏的组培影响较小，可大规模应用。

在愈伤组织转接过程中，多数愈伤组织可分化出丛生芽，但后期容易出现一些问题，比如愈伤组织和培养基接触面出现脓状物、培养基变色以及丛生芽叶片开展较弱等问题，这可能是半夏丛生苗生理状态变差，致使内生菌或附着的细菌成为优势种而产生的脓状物。导致半夏丛生苗生理状态变差的原因，可能是培养容器内恶化的环境，如湿度较大、温度较高以及有害气体增加等，从而导致有害菌增殖。在此情况下，采用无糖培养的方法，把丛生芽的外植体转接在不含糖的蛭石上，经过一段时间，可产生新根，从而挽救生理状态恶化的丛生芽外植体，减少损失。占艳等[17]对半夏无糖组培苗和有糖组培苗的根、叶显微结构进行解剖比较分析发现，无糖半夏组培苗保水能力具有明显优势，组培苗质量明显优于有糖组培苗。

3.4 无糖培养的初步探讨

无糖暴露培养应是半夏进一步培养的方向，从而进一步建立操作简单、成本低廉的培养模式。在无糖培养的相关研究当中，部分植物种类获得成功，且无糖组培苗较有糖培养苗的根系更为旺盛，栅栏组织和海绵组织分化更为明显，组培苗质量更优[18,19]。借鉴无糖培养的理念，对生理状态较差的丛生芽进行处理，转接在用MS 无机盐（无有机物）+IBA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L营养液充分润湿的蛭石中进行培养，丛生芽出现少量叶片和叶柄的枯萎，但有更多的新叶产生，20 d 后取出观察，发现产生部分新根，丛生苗正常生长，该补救措施可减少组培苗的损失。