原子荧光法测定尿中砷的方法优化及分析

梁嘉斌，郭嘉明，郭尧平，陈纠，刘移民

1.广州市第十二人民医院，广东 广州 510620

2.广州市职业病防治院，广东 广州 510620

砷是地壳的天然成分，广泛分布于空气、水和陆地的环境中。砷的无机形态是剧毒的，其中亚砷酸盐［As（Ⅲ）］毒性最大，五价的砷酸盐［As（Ⅴ）］毒性较大，而有机砷毒性较小甚至无毒。人们可通过饮用受污染的水，食用受污染的食品以及职业接触等途径接触到高水平的砷。长期接触或摄入砷及其化合物，可导致慢性砷中毒，皮肤损伤和皮肤癌是最典型的影响。准确测定砷接触人群的体内砷负荷是进行早期防治的关键。我国现行有效的检测尿中砷的卫生行业标准为WS/T 474—2015 《尿中砷的测定 氢化物发生原子荧光法》，该标准推荐的样品前处理方式为“加入混合酸，置电热板上，在较低温度下加热消化至冒白烟、溶液无色透明为止，不得蒸干”，然而该标准并未明确消化的温度和电热板的性能。由于不同品牌和型号的电热板最高额定温度不同，因此可能导致不同实验室的尿砷前处理方式存在较大差异。此外，很多实验室反映使用该方法的检测结果远低于电感耦合等离子体质谱法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）的测定值。因此本研究拟比较不同温度对消化结果的差异，使用有机砷标准物质分析造成这种差异的原因，并以此为基础，建立优化尿中砷测定的原子荧光法。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

AFS-9800 原子荧光光度计（北京海光仪器有限公司），NEXION 350X电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，美国PerkinElmer 公司），砷空心阴极灯（北京有色金属研究总院），HT-300 实验电热板（工作温度：室温～400℃，中国广州分析测试中心），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 主要试剂

硼氢化钾，天津市大茂化学试剂厂，分析纯；氢氧化钠，广州化学试剂厂，分析纯；盐酸、硝酸、硫酸，广州化学试剂厂，优级纯；高氯酸，上海桃浦化工厂，优级纯；硫脲，国药集团化学试剂有限公司，分析纯；抗坏血酸，广州化学试剂厂，分析纯；砷标准溶液，GSBG62028-90（3302），国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院，1 000 mg·L-1；砷甜菜碱，GBW08670，0.518 μmoL·g-1，国家标准物质研究中心；砷胆碱，GBW08671，0.374 μmoL·g-1，国家标准物质研究中心；亚砷酸根，GBW08666，1.011 μmoL·g-1，中国计量科学研究院；砷酸根，GBW08667，0.233 μmoL·g-1，中国计量科学研究院；内标混标（6Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi：10 mg·L-1），美国PERKINELMER。

1.3 实验方法

1.3.1 仪器主要参数原子荧光光度计：光电倍增管负高压270 V，灯电流60 mA，原子化器高度8 mm，屏蔽气流速800 mL·min-1，载气流速400 mL·min-1，以标准曲线法测量，峰面积读数，延迟时间1 s，读数时间10 s，进样体积1.00 mL。ICP-MS：高频发射功率1 300 W，等离子气体（Ar）流速15 L·min-1，辅助气（Ar）流速1.2 L·min-1，雾化气流速0.90 L·min-1，真空度1.3×10-7kPa，镍采样锥孔径1.1 mm，镍截取锥孔径0.9 mm，跳峰测量方式，动态反应池模式（dynamic reaction cell，DRC），反应气（O2）流速0.6 L·min-1，RPq 为0.45，测量点/峰（measuring point）为1，扫描40次，停留时间50 ms·次-1，重复3次。

1.3.2 试剂配制混合酸的配制：分别取硝酸、硫酸和高氯酸按3∶1∶1体积混合。硫脲抗坏血酸的配制：称取12.5 g硫脲，溶于约80 mL纯水中，加热溶解，冷却后，加入12.5 g抗坏血酸，溶解后，加纯水至100 mL。无机砷加标样品的制备：使用正常人混合尿与亚砷酸根［As（Ⅲ），1.011 μmoL·g-1，75.7 mg·L-1以砷计］和砷酸根［As（Ⅴ），0.233 μmoL·g-1，17.5 mg·L-1以砷计］分别制备质量浓度（下称浓度）为151 和175 μg·L-1无机砷加标样品。有机砷加标样品的制备：使用正常人混合尿与砷甜菜碱（0.518 μmoL·g-1，38.8 mg·L-1以砷计）和砷胆碱（0.374 μmoL·g-1，28.0 mg·L-1以砷计）分别制备浓度为388.5 和288.0 μg·L-1有机砷加标样品。标准曲线的制备：使用砷标准溶液［GSBG62028-90（3302）］和正常人混合尿配制0、5、10、20、30、40 μg·L-1标准曲线溶液。

1.3.3 前处理方法标准方法—150℃湿式消解：取5 mL 样品置于锥形烧瓶中，加入15 mL 混合酸，置电热板上，在150℃下（电热板指示温度，下同）加热消化。冷却后，用纯水定量转移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 硫脲抗坏血酸溶液，加纯水至刻度，混匀，供测定。

标准方法—220℃湿式消解：取5 mL 样品置于锥形烧瓶中，加入15 mL 混合酸，置电热板上，在220℃下加热消化至高氯酸白烟散尽。冷却后，用纯水定量转移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 硫脲抗坏血酸溶液，加纯水至刻度，混匀，供测定。

梯度升温湿式消解法：取5 mL 样品置于锥形烧瓶中，加15 mL 混合酸，摇匀后放置过夜，然后置于电热板上加热消解。加热消解温度梯度为150℃消解1 h，220℃消解1 h，320℃消解30 min，消解赶酸至白烟散尽。冷却后，用纯水定量转移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 硫脲抗坏血酸溶液，加纯水至刻度，混匀，供测定。

ICP-MS 法前处理：移取1 mL 样品至10 mL 容量瓶中，以0.5%硝酸溶液稀释定容至刻度，摇匀后对稀释样品进行检测分析。

1.3.4 梯度升温湿式消解法的性能指标验证按GBZ/T 210.5—2008《职业卫生标准制定指南 第5部分：生物材料中化学物质测定方法》对该方法的线性、检出限、定量下限、精密度、准确度和抗干扰能力等性能指标进行验证。

2 结果

2.1 不同消解和检测方法处理尿液测定结果的比较

分别运用150、220℃和梯度升温湿式消解-原子荧光光谱法和ICP-MS 测定高砷正常人、服用砷剂的白血病病人、砒霜中毒病人尿中总砷含量，结果见表1。采用ICP-MS 测定上述样品中总砷含量均值分别为82.68、130.35、236.15 μg·L-1，梯度升温到320℃的湿式消解荧光光谱法测定结果与ICP-MS 法接近，回收率为97.92%～101.16%，而150℃和220℃湿式消解原子荧光光谱法测定的结果回收率均低于90%。

表1 不同消解和检测方法处理尿液后总测定砷结果的比较（n=3）Table 1 Comparison of urinary arsenic determination results by different digestion and detection methods (n=3)

2.2 不同消解和检测方法处理无机砷和有机砷标准品测定结果的比较

从表2可以看出，ICP-MS 的测定结果接近配制浓度，回收率在94.57%～105.26%之间，可见此方法测定准确。当几种砷化合物经过不同温度的湿式消解后，应用原子荧光光谱法测定砷含量，回收率差异极大。其中经过150℃和220℃的湿式消解，砷甜菜碱和砷胆碱几乎无法测出，回收率极低；梯度升温到320℃的湿式消解荧光光谱法测定砷甜菜碱和砷胆碱的回收率分别为97.59%和99.96%；无机砷（亚砷酸和砷酸）经过不同温度的湿式消解后对荧光测定并没有显著影响，测定回收率均大于90%。

2.3 梯度升温湿式消解方法的性能指标验证

2.3.1 线性范围和检出限本方法测定尿砷浓度在5～40 μg·L-1范围内线性关系良好，线性回归方程为Ŷ=91.5X+54.0，相关系数为0.999 7。连续测定11次试剂空白，以3 倍标准偏差计算方法检出限为0.06 μg·L-1，以10 倍标准偏差计算定量下限为0.18 μg·L-1。连续测定11 次总砷含量为0.20 μg·L-1的加标尿液，回收率为112%，精密度为9.4%。

2.3.2 精密度和准确度取空白试管18支，分为3组，每组6 支，每组分别加入砷甜菜碱（mg·L-1以砷计）0.025、0.075和0.150 mL，亚砷酸根［As（Ⅲ），75.7 mg·L-1以砷计］0.010、0.030 和0.060 mL，砷酸根［As（Ⅴ），17.5 mg·L-1以砷计］0.050、0.150 和0.300 mL，随后以正常人混合尿定容至50 mL，配制成总砷浓度分别为52、156 和312 μg·L-1的低、中、高浓度组尿液样品，按照“1.3.3”的梯度升温消解方法进行前处理，计算加标回收率和精密度的相对标准偏差，结果见表3。

表2 不同消解和检测方法对无机砷和有机砷标准品测定结果的比较（n=3）Table 2 Comparison of determination results of inorganic arsenic and organic arsenic standards by different digestion and detection methods (n=3)

表3 准确度和精密度试验结果Table 3 Accuracy and precision test results

2.3.3 抗干扰试验在总砷浓度为52、156和312 μg·L-1的加标样品中，分别加入200 倍于砷水平（60 mg·L-1）的金属离子，包括铅、锌、镉、铜、硒、汞、锑、铁、铝和锰，分别进行测定。由实验结果得知，上述浓度的干扰物对尿砷测定造成的偏差均小于±10%，表明上述金属离子不影响本法对尿中砷的测定。

3 讨论

WS/T 474—2015《尿中砷的测定-氢化物发生原子荧光法》第3.4 条对前处理设备的要求为“电热板，1 000 W”，第7.1 条前处理的步骤为“取5 mL 尿样置于锥形烧瓶中，加入15 mL 混合酸，置电热板上，在较低温度下加热消化至冒白烟，溶液无色透明为止，不得蒸干。冷却后，用纯水定量转移至25 mL 容量瓶中，加纯水至刻度，混匀。取出10 mL 置于另一具塞刻度试管中，加入2.0 mL 硫脲抗坏血酸溶液，混匀，供测定。若样品溶液砷含量超过测定范围，可用纯水稀释后测定，计算时乘以稀释倍数”。该标准并未明确消化的温度，也未对电热板的最高工作温度提出要求。由于硝酸和高氯酸的沸点较低，220℃的消化温度已足以使混合酸中的硝酸和高氯酸沸腾而冒白烟。此外，据调查，现在市面上常用的电热板以及石墨消解仪的最高温度多在220℃以下。然而，由于有机砷中的砷原子与碳原子间具有结合力很强的化学键，需要较剧烈的实验条件才能破坏砷碳键的键能，有资料表明，在湿法消解处理中需要加热达到300℃的条件，才可破坏有机砷化合物［1］，而本次对砷甜菜碱和砷胆碱标准品的消化实验也证明了150℃和220℃的湿式消化无法有效将有机砷分解为无机砷。在食品检测领域，有多个研究证明200℃湿式消解和微波消解［1］均难以把有机砷完全消解为无机砷。而在ICP-MS 测定时，虽不能在前处理时将尿液中的有机砷完全消解为无机砷，但样品消解液通过可达10 000 K 高温的等离子体后，各类砷化合物中的砷元素均转化为砷离子，再通过质谱检测，由此可以得到准确的结果。

不同人群的尿中含有不同比例的有机砷，对健康志愿者的砷形态学研究发现，食用海鲜组的尿液中检出砷甜菜碱平均含量是未食用海鲜组的2.38 倍，而且食用海鲜组志愿者尿液中的砷甜菜碱含量远高于无机砷［2］。此外，尿液中的As（Ⅲ）和As（Ⅴ）含量随存储时间增加而减少，而有机砷含量随存储时间增加而变大［3］。由此可见有机砷消化不完全将导致总砷测定值偏低，这可能是多个实验室使用原子荧光法测定尿中砷结果低于ICP-MS 的原因。

《尿中砷的测定-氢化物发生原子荧光法》以硝酸-硫酸-高氯酸体系来消化样品，其中高氯酸是强氧化剂，遇有机物可发生剧烈氧化反应造成有机物迅速分解，放热压力急剧升高而爆炸，因此本研究使用放置过夜和梯度升温的方式，除去有机物和高氯酸，提高实验安全性。本实验证明320℃以上的梯度升温，能把砷甜菜碱和砷胆碱等有机砷转换为无机砷。但该方法也存在局限性，主要是耗费时间长，并需要专人看护，需要最高温度可达320℃以上的电热板，如果消化程序不规范或实验人员经验不足，很可能因生成三氯化砷（沸点130℃）而挥发损失，也可能因为蒸干或升温过快、过高导致炭化而损失。为了避免上述问题，消解时需要进行梯度升温，且升温速度不可过快，如果消解时出现炭化的趋势（试样开始变黑）应取下放置到室温后继续加混合酸消解，直到样品清亮透明。