千斤拔混合粉对大鼠骨结构功能的改善作用

郭橹橹，谢宏晨，刘力进，唐萌萌，黄毅娜

四川大学 a.华西公共卫生学院 b.华西第四医院，四川 成都 610041

骨质疏松症（osteoporosis，OP） 是一种以骨脆性增加和易发生骨折为特征的全身性疾病，为老年人尤其是绝经后老年妇女的一种常见病、多发病［1］。随着我国人口老龄化的加重，OP 已成为我国将要面临的重要公共卫生问题［2］。另一方面，OP 病程较长，具有预防作用的保健食品有着广阔的应用前景。我国保健食品开发的一个最主要特点就是中医药理论与现代研究成果联合应用，以药食两用的中药为原料，极具中国特色，也符合“回归自然，返璞归真”的世界消费潮流［3］。大量研究表明，传统中药淫羊藿、补骨脂能有效改善OP患者骨代谢、提高骨密度，是防治骨质疏松的常用中药配方［4-8］。千斤拔作为常用中药，含有丰富的异黄酮类化合物，具有植物雌激素作用，并有抗骨质疏松的治疗潜力［9-10］。然而目前鲜有含千斤拔成分的用于骨质疏松防治的保健食品的研发。

本项目探究性地研制千斤拔配方组合，初探其安全性，并利用去势雌鼠骨质疏松模型，验证其对大鼠骨密度的影响；另一方面深入研究千斤拔提取物促进体外成骨细胞增殖分化能力，探讨千斤拔改善骨骼功能的可能机制。本项目为千斤拔作为保健食品成分或药物，用于防治OP 提供一定的参考与理论依据。

1 对象与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 千斤拔混合粉配方与原料依据《本草纲目》等中药理论，并参考《中华人民共和国药典》《保健食品注册与备案管理办法》、2013年版《中国居民膳食指南》和2011年中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会《原发性骨质疏松症诊疗指南》（后简称“指南”）等现代研究成果，制定各成分组成和用量［11-14］。设计的千斤拔混合粉组配方为：千斤拔110 g，补骨脂80 g，淫羊藿80 g，硫酸软骨素70 g，维生素D 10 mg，生物碳酸钙160 g。以指南推荐的老年人维生素D 摄入量800 IU 为依据［11］，设置本配方的人体推荐每日摄入量为2 g，其他成分含量均符合标准或指南推荐范围。面粉混合粉组是将千斤拔换成同等质量的面粉，其他成分组成不变。

千斤拔、补骨脂、淫羊藿原药购于成都荷花池中药材专业市场，原药经四川大学生命科学院鉴定；维生素D（Solarbio，美国）；生物碳酸钙（安徽仟顺生物科技有限公司，中国）；硫酸软骨素A（上海源叶生物科技有限公司，中国）；小麦粉（成都人民食品厂，中国）。中药材粉碎后与其他成分混合制成粉末，于4℃冷藏保存。

1.1.2 实验动物SPF 级SD 大鼠，由成都达硕实验动物有限公司提供［许可证号：SCXK（川）2015-030］。动物饲养于四川大学华西公共卫生学院实验动物房［许可证号：四川省实验动物管理委员会SYXK（川）2018-011］。基础饲料由成都达硕实验动物有限公司提供［许可证号：SCXK（川）2014-028］，并经辐照灭菌后密封常温干燥保存。实验期间大鼠自由摄食和饮水，温度20～24 ℃，相对湿度53%～65%。本研究已经四川大学华西公共卫生学院动物管理委员会评估，批准号：研（审）2019001。

1.1.3 试剂与仪器淫羊藿苷（上海麦克林生化科技有限公司，中国）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色液（改良Gomori 钙钴法）（北京索莱宝科技有限公司，中国）；ALP 测试盒（酶标仪法）（南京建成生物工程研究所，中国）；BCA 法蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所，中国）；细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8（东仁试剂，日本）；低糖DMEM 培养基（Hyclone，美国）；II型胶原酶（Sigma，美国）等。

Multiskan GO 酶标仪（ThermoFisher Scientific，美国）；CKX41SF 倒置相差显微镜（OLYMPUS，美国）；1736R 冷冻高速离心机（SCANSPEED，美国）；旋转蒸发仪（上海荣亚生化公司，中国）；MCO-15AC 型二氧化碳培养箱（上海SANYO，中国）；病理取材及切片制作设备（LEICA，美国）；原子吸收分光光度计（PerkinElmer，美国）；小动物全自动高分辨率X 线机（BRUKER，美国）等。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠急性毒性试验根据GB 15193.3—2014《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》，采用限量法，取180～200 g SPF级SD大鼠20只（雌雄各半）进行实验。受千斤拔混合粉溶解性的限制，设10 g·kg-1（以体重计）为一个剂量组，以20 mL·kg-1（以体重计）灌胃2次，间隔4 h，观察14 d。实验结束时根据中毒和死亡情况，进行毒性分类。

1.2.2 去势大鼠骨结构功能实验采用去势成年雌鼠建立骨质疏松模型。选择180～220 g SPF级成年雌性未孕SD大鼠32只，按体重分层后随机分为4组：假手术组、模型对照组、模型+千斤拔混合粉组和模型+面粉混合粉组，每组8只。大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，在背部肋脊角处备皮消毒。除假手术组外其他3 组大鼠行双侧卵巢切除手术，假手术组大鼠仅切除少量脂肪。假手术组和模型对照组大鼠予以同等剂量的纯水灌胃，另两个实验组分别用相应配方按1 g·kg-1（以体重计）的剂量（相当于人体推荐量的30倍）以10 mL·kg-1（以体重计）灌胃。每天1 次，持续13 周，每周称重记录。13 周后安乐处死大鼠，取左侧股骨用小动物全自动高分辨率X 线机测量骨密度后，股骨经脱钙、切片，HE 染色观察骨结构变化，并使用软件motic images advanced 3.2 测量骨皮质的厚度。右侧股骨烘干至恒重并称量记录股骨干重，经消化后利用原子吸收法进行骨钙质量分数（后称：含量）的测定。

1.2.3 千斤拔提取物的制作与最佳洗脱梯度的筛选取千斤拔粉末40 g，加入1 L 体积分数75%的甲醇（无水甲醇与纯水配制）磁力搅拌4 h，超声辅助提取90 min 后离心，取上清液进行旋蒸得到浸膏。再使用AB-8 型大孔吸附树脂分离纯化千斤拔总黄酮，分别用1 L 体积分数分别为0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇依次洗脱层析柱［15-16］，并采用硝酸铝显色法测定千斤拔提取物中总黄酮质量分数（后称：含量）［17］。

将纯化的各洗脱组分提取物分别与成骨细胞共培养，培养方法见1.2.5，根据细胞培养结果和千斤拔提取物总黄酮含量筛出效果最佳的洗脱组分进行后续研究。

1.2.4 成骨细胞分离、培养与鉴定取新生SD 大鼠（24～72 h）10只，处死后在75%酒精中消毒10 min，无菌手术取出颅盖骨并用无菌PBS 冲洗至白色，再将头盖骨剪成0.5 mm×0.5 mm 的碎片。加入0.25%胰蛋白酶消化处理，PBS 洗涤后静置沉淀，弃上清液。再加0.1%胶原酶溶液于37℃恒温摇床上消化1 h，弃去消化液后用适量含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM 培养液重悬细胞，吹匀。以2.0×105个·mL-1的细胞密度接种于培养板上，于37℃含5% CO2的孵箱培养，用差速贴壁法初步纯化成骨细胞。镜下观察直至细胞完全贴壁后，更换培养液，每3 d换液1 次并观察细胞生长状况［18-20］。将第三代细胞接种于24孔板，采用改良Gomori 氏钙钴法进行ALP染色，显微镜下观察鉴定并拍照记录［21-22］，成骨细胞核染为蓝紫色，表明同代细胞可用于实验。

1.2.5 成骨细胞CCK-8 试验和ALP活性测定调整细胞密度为4×104个·mL-1接种于96 孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，设3 个复孔，培养24 h 后，分别加入不同洗脱梯度的千斤拔提取液，加样浓度为1、0.5 g·L-1，加药后继续培养72 h，48 h 时换液1 次。另设0.4 g·L-1淫羊藿苷阳性对照组和0.1% DMSO 溶剂对照组。每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，根据CCK-8 试剂盒说明书，用酶标仪在波长450 nm处测定各孔的光密度（D）值，根据D值计算细胞增殖率［23］，筛选出最佳洗脱梯度。公式如下：

在最佳洗脱梯度下，同上述方法再分别加入不同浓度（1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 g·L-1）的千斤拔提取液，培养24、48、72 h，测定细胞增殖率。

同上述方法加入细胞和千斤拔提取液，根据ALP测试盒（酶标仪法）说明书，用酶标仪在波长520 nm处测定各孔的光密度（D）值，并计算ALP 活性［24-25］，公式如下：

式中：标准品质量浓度（ρ标准品）为0.02 g·L-1；酶活性单位定义为1 L 血清或液体在37℃与基质作用15 min 产生1 mg 酚即为1个金氏单位，简写为U·L-1。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠急性毒性试验结果

10 g·kg-1千斤拔混合粉经口染毒后，两周内未出现大鼠死亡，也无明显中毒症状，大鼠体重增重在正常范围内，详见表1。对动物进行大体解剖，未见任何异常，千斤拔混合粉对雌、雄性SD 大鼠的急性经口LD50＞10 g·kg-1，根据GB 15193.3—2014《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》，属实际无毒级别。

表1 10 g·kg-1千斤拔混合粉急性染毒后SD大鼠体重变化（±s）Table 1 Effect of acute exposure to 10 g·kg-1 Flemingia macrophylla mixed powder on body weight of SD rats (±s)单位（Unit）：g

表1 10 g·kg-1千斤拔混合粉急性染毒后SD大鼠体重变化（±s）Table 1 Effect of acute exposure to 10 g·kg-1 Flemingia macrophylla mixed powder on body weight of SD rats (±s)单位（Unit）：g

性别 动物数 第0天 第7天 第14天雄 10 210.5±7.60 290.5±10.71 351.1±18.31雌 10 197.1±8.05 235.5±10.27 252.7±13.22

2.2 去势大鼠骨结构功能实验结果

2.2.1 大鼠体重与假手术组相比，模型对照组从第1 周末开始，体重均明显升高（P＜0.05）。与模型对照组相比，千斤拔混合粉组和面粉混合粉组初始体重、实验中和实验末体重差异均无统计学意义（P＞0.05），具体见图1。

图1 干预13周前后实验各组大鼠体重变化（n=8）Figure 1 The changes of body weight of rats in each group after 13 weeks of intervention (n=8)

2.2.2 大鼠股骨结构改变与假手术组相比，模型对照组骨钙含量、骨密度和骨皮质厚度降低（P＜0.05）。与模型对照组相比，千斤拔混合粉组和面粉混合粉组的骨密度、骨皮质厚度值均升高（P＜0.05）；并且，相比于面粉混合粉组，千斤拔混合粉组的骨皮质厚度升高（P＜0.05），具体见表2。

表2 干预13 周后实验各组大鼠股骨的干重、骨钙含量、骨密度及骨皮质厚度（n=8，±s）Table 2 Effects on dry weight,bone calcium content,bone mineral density,and bone cortical thickness of femur in rats in each group after 13 weeks of intervention (n=8,±s)

表2 干预13 周后实验各组大鼠股骨的干重、骨钙含量、骨密度及骨皮质厚度（n=8，±s）Table 2 Effects on dry weight,bone calcium content,bone mineral density,and bone cortical thickness of femur in rats in each group after 13 weeks of intervention (n=8,±s)

［注］#：与假手术组相比，P＜0.05；*：与模型对照组相比，P＜0.05；▲：与面粉混合粉组相比，P＜0.05。

左骨皮质厚度/μm假手术组 0.65±0.03 0.67±0.07 234.29±11.45 525.56±99.91模型对照组 0.60±0.03# 0.74±0.05# 215.41±15.79# 237.37±61.59#面粉混合粉组 0.64±0.03* 0.73±0.07 209.07±27.58 302.87±64.83*千斤拔混合粉组 0.64±0.02* 0.73±0.07 219.09±10.41 376.01±51.52*▲组别 左股骨骨密度/（g·m-2）右股骨干重/g右股骨钙/（mg·g-1）

2.2.3 大鼠股骨病理组织假手术组大鼠的骨小梁结构紧密、数目较多，分离度小，连续性好；与假手术组相比，模型对照组的骨小梁明显变稀疏，数目变少，出现较大的间隙；而与模型对照组相比，千斤拔混合粉组和面粉混合粉组骨小梁数目明显增多，分离度变小，骨小梁结构变紧密，连续性较好，且千斤拔混合粉组骨形态明显优于面粉混合粉组，具体见图2。

图2 干预13周后实验各组大鼠股骨骨小梁的组织病理学情况（HE，×40）Figure 2 The histopathological changes of femoral trabeculae of rats in each group after 13 weeks of intervention (HE,×40)

2.3 大鼠颅骨原代成骨细胞离体培养结果

2.3.1 细胞形态观察倒置显微镜下观察原代细胞，前3 d为小而圆的细胞，第3天时，细胞呈长梭状、三角形、不规则多边形，见图3A。第5天时，细胞多为不规则多边形，并且有数量不等的突触围绕着细胞核生长，胞质透亮并有少量颗粒，核圆位于细胞中央且核仁明显，核内有1～2个核仁，见图3B。第7天时，细胞呈现铺路石状，细胞变短变宽，胞质内颗粒较多，细胞核呈现椭圆形，核内有一个或多个核仁，见图3C。

图3 倒置相差显微镜下大鼠颅骨原代成骨细胞第3、5、7 天时的生长情况（×200）Figure 3 Growth of primary calvarial osteoblasts of rats on day 3,5,and 7 under inverted phase contrast microscope (×200)

2.3.2 细胞染色鉴定结果改良Gomori 氏钙钴法进行ALP 染色，倒置显微镜下观察成骨细胞形态，呈铺路石状，显示细胞内有棕黑色细微颗粒，培养的成骨细胞能合成ALP，可用于后续实验。见图4。

2.4 千斤拔提取物最佳洗脱梯度筛选及其与细胞作用结果

图4 倒置相差显微镜下原代成骨细胞改良Gomori氏钙钴法染色情况（×200）Figure 4 Staining of primary osteoblasts by modified Gomori’s calcium-cobalt method under inverted phase contrast microscope(×200)

经预试验，除0%甲醇洗脱梯度外，其他洗脱梯度的千斤拔提取物均可提高成骨细胞ALP活性，且40%、60%和80%甲醇洗脱梯度效果最明显，这与所测的相应浓度千斤拔提取物中总黄酮检测结果相一致。60%甲醇洗脱时，成骨细胞ALP 活性较高且该浓度下受试物对细胞增殖抑制效果较弱，同时总黄酮含量较高，故选取60%作为千斤拔提取物最佳甲醇洗脱梯度。

在最佳洗脱梯度（60%甲醇）下，与溶剂对照相比，0.4 g·L-1淫羊藿苷与成骨细胞作用24 h、48 h 及72 h 后细胞增殖率均升高，ALP 活性除72 h 外，其余时间段均增加，差异有统计学意义，表明试验方法可靠。详见表3、4。

表3 不同浓度千斤拔提取物与细胞作用不同时间后细胞增殖率（±s）Table 3 Cell proliferation at different concentrations of Flemingia macrophylla extract for different treatmenttime (±s)单位（Unit）：%

表3 不同浓度千斤拔提取物与细胞作用不同时间后细胞增殖率（±s）Table 3 Cell proliferation at different concentrations of Flemingia macrophylla extract for different treatmenttime (±s)单位（Unit）：%

［注］*：与溶剂对照相比，P＜0.05。

组别［剂量/（g·L-1）］24 h 48 h 72 h溶剂对照 0.0 0.0 0.0淫羊藿苷 （0.4） 34.7* 11.7* 11.8*千斤拔提取物（0.2） 6.8 -9.0* -4.5（0.4） -3.6 -18.4* -16.8*（0.6） -9.2 -23.4* -23.9*（0.8） -10.1 -25.8* -29.9*（1.0） -12.3 -28.1* -30.1*

表4 不同浓度千斤拔提取物与细胞作用不同时间后ALP活性（±s）Table 4 ALP activity at different concentrations of Flemingia macrophylla extract for different treatmenttime (±s)单位（Unit）：U·L-1

表4 不同浓度千斤拔提取物与细胞作用不同时间后ALP活性（±s）Table 4 ALP activity at different concentrations of Flemingia macrophylla extract for different treatmenttime (±s)单位（Unit）：U·L-1

［注］*：与溶剂对照相比，P＜0.05。

组别［剂量/（g·L-1）］24 h 48 h 72 h溶剂对照 22.0±1.8 20.4±0.5 28.8±2.1淫羊藿苷 （0.4） 28.9±1.1* 23.9±1.4* 23.0±0.3*千斤拔提取物（0.2） 26.5±3.0* 24.2±1.7* 32.4±1.6*（0.4） 26.8±0.8* 24.9±1.7* 30.2±3.7（0.6） 26.7±0.9* 26.8±0.9* 34.2±2.2*（0.8） 28.6±2.1* 27.2±1.1* 35.7±0.0*（1.0） 31.9±2.7* 29.8±0.5* 35.7±0.6*

与溶剂对照相比，不同浓度千斤拔提取物均具有提高ALP 活性的作用，却均呈现出对细胞增殖的抑制作用。随着培养浓度的增加，ALP 活性呈上升的趋势，且细胞增殖活性呈下降趋势。与溶剂对照组相比，作用48 h 后各剂量组细胞增殖率差异有统计学意义（P＜0.05）；作用72 h后除了0.2 g·L-1组外，其余剂量组细胞增殖率差异有统计学意义（P＜0.05）；作用24 h后对各剂量组细胞增殖活性无影响（P＞0.05）。详见表3。与溶剂对照组相比，作用24、48 h 后所有剂量组ALP 活性均有提高（P＜0.05）；作用72 h 后，除了0.4 g·L-1组外，其余剂量组ALP活性也提高（P＜0.05）。详见表4。

3 讨论

饮食调节、运动和药物（钙剂、激素等）治疗等方式是防治骨质疏松的有效措施，但可能引起诸如骨硬化、静脉血栓等不良反应［26］。近年来，更多的医、药学研究者致力于采用中药治疗骨质疏松并取得良好的效果［27-29］。千斤拔这一中药，是我国西南地区的民间用药，有多种确切的药用历史，具有祛除风湿、止痛消炎、强壮筋骨等功效，但对千斤拔与骨质疏松之间的基础医学研究较少。本配方选用千斤拔、淫羊藿、补骨脂等中药材为原料，是专为骨质疏松人群设计的一种具有增加骨密度、改善骨功能的保健食品。本实验对该配方的安全性及其增加骨密度功能进行验证，并对其细胞机制进行初步探究。

急性毒性实验结果表明，千斤拔混合粉组急性毒性属实际无毒级别。另一方面，本研究采用的去势法建模为美国食品与药品监管局和世界卫生组织推荐的骨质疏松症最佳研究方法［30］。大鼠摘除卵巢后，雌激素分泌大幅下降，通过直接调节、旁分泌通路及相应的免疫功能，继发内分泌失调，骨代谢紊乱，引发骨吸收-骨形成耦联失衡，骨量严重丢失，导致机体体重迅速增加来代偿性弥补骨量丢失，产生“代偿性肥胖”。雌性动物去势后形成的骨质疏松与人类绝经后骨质疏松形成机制相同，故为研究骨质疏松的最佳动物模型。本实验中相较于假手术组，模型对照组的大鼠体重明显升高，而骨钙含量、骨密度和骨皮质厚度明显降低，综合以上指标说明本次去势大鼠骨质疏松模型成功建立［31］。在成功建模的基础上，发现千斤拔混合粉组骨密度、骨皮质厚度高于模型对照组，且前者骨皮质厚度高于面粉混合粉组。骨组织病理结果显示，与模型对照组相比，千斤拔组骨小梁数目明显增多，分离度变小，结构变紧密，连续性较好，并且千斤拔组对骨组织的改善情况显著优于面粉混合粉组，Ho 等［32］的研究表明千斤拔在骨骼功能上表现为类雌激素活性，可抑制骨吸收。

淫羊藿为经典增骨药材，其有效化学成分黄酮类化合物可促进成骨细胞增殖分化［33-34］，故进一步以淫羊藿苷为阳性对照，通过细胞实验验证千斤拔的具体作用。本研究采用CCK-8 法检测受试物对成骨细胞增殖活性的影响，作为四甲基偶氮唑盐法的替代方法，前者具有简便、快速、灵敏度高等优势［35］。另一方面，ALP 是一种同源二聚体的糖蛋白，作为成骨细胞分化的最早期生化标志，细胞分化时向细胞间质分泌ALP，ALP 水解磷酸酯，提供无机磷酸盐给羟基磷灰石，并水解无机焦磷酸酶，抑制其对羟磷灰石的分解作用，进而促进骨矿化［36］。成骨细胞富含ALP，具有促进细胞成熟、钙化的作用，其活性可作为评价成骨细胞分化程度的良好指标［18］。结果表明在最佳洗脱梯度—60%甲醇洗脱下，与溶剂对照相比，不同浓度千斤拔提取物均具有提高ALP活性的作用，却均呈现出对细胞的抑制增殖作用。随着培养时间和浓度的增加，ALP活性呈上升的趋势，且细胞增殖活性呈下降趋势。镜下观察各组别细胞形态并未出现变圆、皱缩、脱落等凋亡状态，说明抑制细胞增殖的方式并非使细胞凋亡，推测可能是细胞分裂周期阻滞导致的［37］，出现这样的情况可能与千斤拔提取物中某些化合物有关。有关千斤拔化学成分的研究表明，千斤拔属植物中含有黄酮类、酚酸类、鞣质类、生物碱类等物质［38］，其中黄酮类和酚酸类物质含量较高。与淫羊藿中富含的公认具有良好增骨作用的黄酮不同，酚酸类物质是具有抑菌活性的成分，中药材中常见的酚酸类物质丹酚酸B 可增加成骨细胞ALP 活性，有显著的促进成骨细胞分化成熟和矿化的作用，但同时却无促进细胞增殖作用，高浓度下甚至会抑制增殖［39］。且有文献报道，丹酚酸B 对大鼠传代肝贮脂细胞和星状细胞的增殖有抑制作用，其机制可能是丹酚酸B 在上游抑制了促进细胞增殖的某些环节［40］。结合镜下观察的细胞状态，推测在本研究浓度剂量下，千斤拔提取物中的酚酸类物质抑制了成骨细胞的增殖，却以另一种方式促进成骨细胞的分化，使成骨细胞进一步成熟，该特点对改善骨功能有着重要的意义。

综合体内、体外实验结果，千斤拔具有一定的改善骨结构功能的作用，可能是通过改善骨代谢，促进成骨细胞的分化成熟来实现的［41］。本项目证明了该增骨配方设计的有效性，且填补了这方面研究的空白，为研发保健食品增骨配伍提供可选材料和理论依据。然千斤拔的提纯工艺有待进一步优化，且其增骨功效和作用机制还需进一步研究，未来可完善骨生物力学相关评价指标，更深入地反映千斤拔的改善骨结构功能作用，且需进一步探索成骨细胞分化信号通路相关mRNA和蛋白的表达。