暗色真菌感染病原学诊断方法和治疗药物研究进展

景丹蕤 李筱芳,2 刘维达，2

(1.中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京 210042；2.江苏省皮肤病与性病学分子生物学重点实验室，南京 210042)

暗色真菌是一组孢子和/或菌丝的壁具有黑色素样颜色的真菌，是一种广泛存在于自然界的腐生寄生生物，包括大约70个属和150个种[1]。暗色真菌可引起皮肤组织和内部脏器深部真菌感染，导致着色芽生菌病、暗色丝孢霉病和足菌肿等。此类感染致病菌种类繁多，临床表现缺乏特异性，诊断和治疗较为困难。病原菌准确和快速的鉴定有助于早期明确诊断，新的抗真菌药物的研发可帮助临床工作者对暗色真菌的感染更加合理地选择治疗药物。本文将围绕暗色真菌感染病原学诊断方法和治疗药物研究的进展作一综述。

1 病原学诊断方法的研究进展

组织病理切片和真菌培养是传统的暗色真菌感染的病原学确诊手段，前者通常被视为其金标准。但这种基于表型特征的形态学鉴定对鉴定人员的素质要求较高，且周期较长，在大多数时候仅能鉴定到属水平，不能满足临床早期特异性诊断的要求。近年来分子鉴定、MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry)等的应用大大提高了暗色真菌检测的敏感度，缩短了鉴定时间，还可深入提供致病菌的分型、耐药基因和毒力因子分析等，具有传统诊断方法不可比拟的优势，可更好地指导个体化治疗。

1.1 分子鉴定技术

随着现代生物学的进步，对暗色真菌核糖体DNA(rDNA) D1/D2区域和内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)的序列分析已成为鉴定暗色真菌的有效手段[2,3]，特别是ITS区域已被广泛地视为暗色真菌分类的通用条形码[4]。此外，β-微管蛋白、肌动蛋白、钙调蛋白、锰超氧化物歧化酶、ATP酶亚基6、几丁质合成酶、线粒体小亚基rRNA和真核延伸因子-1α等基因的测序也可用于鉴别菌种[5]。但尚未见比较不同基因序列鉴定不同种属暗色真菌的特异性和敏感性的研究报道。此外，分子鉴定具有耗时短、敏感性高、特异性强等优点，但由于现有GenBank数据库的信息有限及编码暗色真菌黑色素的DNA 片段可抑制PCR扩增[6,7]，因此，分子鉴定在识别部分菌种时仍存在困难。如Singh等[6]从印度19个医疗中心的患者中分离出72株共21属，29种暗色真菌，利用ITS、D1/D2区域和β-微管蛋白标记仅鉴定出其中90%的菌种，对Corynespora属和Rhytidhysteron属的4株分离株无法将其鉴定到种的水平。

1.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS作为一种准确、可靠、快速的诊断技术，其所花费的时间要远远低于DNA测序所用时间[8]。在Singh等[6]的研究中，使用MALDI-TOF MS仅鉴定出29种暗色真菌中的6种(20%)，这可能与其使用的Bruker数据库菌种信息的有限性(仅包含16属25种暗色真菌)有关。但通过将该研究中其他未收录在Bruker数据库中的菌株置于沙堡弱葡萄糖液体培养基中生长24～96 h，使用乙醇-甲酸萃取法来提取蛋白质，最后用MALDI-TOF MS Biotyper OC系统(版本 3.1)鉴定菌株并创建内部数据库，该研究成功鉴定了另外14属20种暗色真菌。Paul等[8]在此基础上改进了蛋白提取方案，通过纳入59株共20属，26种暗色真菌来创建内部数据库。并用117株暗色真菌进行验证，达到了100%的识别率。经过检测，MALDI-TOF质谱的总体准确性与DNA测序相当。此外，在Paul等的观察中，发现基于DNA测序鉴定菌株需花费5～9 d，而通过MALDI-TOF MS鉴定出所有的暗色真菌仅花费了3～7 d。这说明随着数据库的完善，MALDI-TOF MS有望具有比分子鉴定更快速简便更低成本的优势。

2 治疗药物的研究进展

目前暗色真菌感染的治疗以系统性抗真菌药物为主，除了伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B等常用药物外，泊沙康唑(posaconazole)、拉夫康唑(ravuconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、卢立康唑(luliconazole)、拉诺康唑(lanoconazole)、艾氟康唑(efinaconazole)以及与常用抗真菌药物具有协同作用的药物的研究也取得了一定进展，使得治疗药物的选择更为多样化。

2.1 新型唑类药物

泊沙康唑 是伊曲康唑的衍生物，为广谱三唑类抗真菌药物，其亲脂性与伏立康唑相近，后者在中枢神经系统组织中可达到较高的浓度，有报道证实泊沙康唑可能也是目前治疗中枢性暗色丝孢霉病的最佳三唑类药物[9]。此外，泊沙康唑是唑类药物中最有效的抗链格孢菌药物[10-12]，其MIC值通常较低，组织分布良好，与伊曲康唑相比药物相互作用较少，可作为治疗皮肤链格孢菌感染的最佳选择[13-15]。

拉夫康唑和艾沙康唑 也属于三唑类的抗真菌药物，均为氟康唑的衍生物。艾沙康唑的药物分子与真菌甾醇合成过程中的关键酶——羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)具有相比于其他唑类药物更强的亲和力，因此其抗真菌谱还涵盖了一些对其他三唑类药物耐药的少见菌[16]，例如阿萨希毛孢子菌、红酵母属、地丝菌属、毕赤酵母属等[17]。在Zheng等[18]的研究中，通过检测3种棘白菌素类药物(阿尼芬净、米卡芬净、卡泊芬净)和8种非棘白菌素类药物(拉夫康唑、艾沙康唑、氟胞嘧啶、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑和两性霉素B)对84株暗色真菌的体外最小抑菌浓度，发现对于大部分菌种，拉夫康唑和艾沙康唑具有优于伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑及棘白菌素类药物的抑菌效果。美国FDA已于2015年3月批准艾沙康唑作为侵袭性曲霉病和毛霉病的主要治疗药物，拉夫康唑也作为治疗甲真菌病的口服制剂于2018年在日本上市[19,20]，但这两种药物治疗暗色真菌感染的临床安全性和有效性尚未见报道。

卢立康唑、拉诺康唑和艾氟康唑 这三种药物同样通过抑制CYP51来干扰真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成，已被批准用于治疗足癣和甲真菌病，其中艾氟康唑也为氟康唑的衍生物[21-23]。对暗色真菌的28株临床分离株和102株环境分离株进行体外试验发现，与传统抗真菌药物(伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B和氟康唑)相比，卢立康唑的平均MIC值最低，其次是拉诺康唑和艾氟康唑。其MIC值几何均数依次为：临床分离株0.0008 μg/mL、0.0028 μg/mL、0.0966 μg/mL；环境分离株0.002 μg/mL、0.009 μg/mL、0.10 μg/mL。而传统药物中，对临床分离株MIC值几何均数最低的为伊曲康唑(0.2383 μg/mL)，对环境分离株MIC值几何均数最低为伏立康唑(0.20 μg/mL)[24]。由此可见，新的三唑类药物较传统药物体外抗菌活性更强，具有良好的临床应用前景。

2.2 与唑类药物具有协同作用的药物

Hsp90抑制剂 热休克蛋白Hsp90是一种高度保守的分子伴侣，是真菌耐药、应激反应、形态转换以及毒力相关的细胞通路枢纽[25]。研究发现真菌通过应激反应来抵抗药物对细胞膜和细胞壁的损伤作用，而阻断Hsp90在真菌应激通路中的作用或可避免真菌耐药并显著增加抗真菌药物的疗效[26]。17-AAG(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin)是一种有效的Hsp90抑制剂，在Gao等[27]的研究中，通过对18株皮炎外瓶霉分离株进行检测，发现17-AAG可增强唑类药物对皮炎外瓶霉的抗真菌活性。与单独使用相比, 17-AAG与泊沙康唑、伊曲康唑和伏立康唑联合使用分别对15株(83.3%)、12株(66.7%)和1株(5.6%)皮炎外瓶霉菌株有协同作用，这在治疗皮炎外瓶霉感染方面可能具有极其重要的意义。但由于Hsp90的结构在真核生物中高度保守，现有的Hsp90抑制剂缺乏真菌特异性且具有人体细胞毒性，限制了其在抗真菌治疗中的应用。需要更多的努力来开发真菌特异性的Hsp90抑制剂。

钙调神经磷酸酶抑制剂 钙调神经磷酸酶是一种Ca2+-钙调素依赖性蛋白磷酸酶，在真菌的各种生理过程及药敏性和毒性中发挥着重要作用，钙调神经磷酸酶抑制剂已被证明能使唑类药物具有杀菌作用[28,29]。有学者发现[30]，钙调神经磷酸酶的靶向抑制药物他克莫司，与伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑联合使用时，分别对11株(68.8%)、14株(87.5%)和16株(100%)的皮炎外瓶霉菌株表现出良好的协同作用。这提示钙调神经磷酸酶抑制剂能使唑类药物的抗暗色真菌活性增效。但需注意的是，他克莫司作为一种免疫抑制剂，有诱发真菌感染的可能性，且目前对这类药物的研究仅局限于体外试验，故其用于临床真菌感染的可行性尚有待验证。

3 结 语

由于暗色真菌的种类繁多，不同种类的菌株对抗真菌药物的敏感性不同，目前尚缺乏大样本的暗色真菌感染的临床试验资料，其治疗数据多来源于零散的病例报告。随着对此类感染的日益重视，诊断方法的不断改良，疗效更佳的新药物的不断研发，以及临床研究的日益深入，对暗色真菌的感染将有望实现高敏感、高特异性的早期诊断及针对性更强的个体化治疗。