艾滋病合并新生隐球菌感染的研究进展

高丽 杨丹丹

(1.云南省传染病医院/云南省艾滋病关爱中心，昆明 650301；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500；3.昆明医科大学，昆明 650500)

新生隐球菌感染是全世界艾滋病患者死亡的主要原因，尤其是在撒哈拉以南非洲地区发病率最高[1]。新生隐球菌除了容易感染HIV个体外，还易感染其他免疫功能低下的个体，如造血系统恶性肿瘤、器官移植后服用免疫抑制剂及免疫缺陷病患者。格特隐球菌主要侵犯免疫功能正常的个体，但也感染免疫功能低下患者如合并艾滋病毒的患者[2]。

隐球菌病是结合临床表现以及实验室检查确诊。临床上治疗药物包括两性霉素B、三唑类抗真菌药物和氟胞嘧啶。因而隐球菌病越来越受到临床医生的关注，现就新生隐球菌的研究现状综述如下。

1 新生隐球菌的致病机制和血清型

新生隐球菌感染人体主要通过呼吸道和皮肤侵入，由菌体和荚膜组成，荚膜是主要的致病因子。体外隐球菌无荚膜包裹，随尘埃被吸入呼吸道内，进入肺泡在细胞内的高尔基体合成荚膜多糖，再由囊泡运输至胞外与质膜融合形成荚膜。带荚膜的菌体在穿越上皮细胞和内皮细胞屏障时与上皮细胞结合使细胞紧密结构断裂及骨架改变，产生跨细胞作用，穿越脑微血管内皮细胞。早期认为带荚膜的隐球菌才具有致病性，且荚膜的薄厚与致病性呈正相关。但近期通过电子显微镜观察显示，无荚膜或小荚膜菌株侵入内皮细胞的能力强于大荚膜菌株，荚膜越小的细胞穿透力越强，荚膜大小与隐球菌毒力呈负相关[3,4]。新生隐球菌的菌体经肺部通过血液循环进入中枢神经系统，具有嗜神经组织性，且可透过血脑屏障，在脑脊液中生长繁殖，导致新生隐球菌性脑膜炎。此病可见于任何年龄，常常隐匿起病，亚急性或慢性病程，缓慢进展，逐渐加重。新生隐球菌在中枢神经系统的感染，以脑膜炎最为常见。初期可有上呼吸道感染或肺部感染史，主要表现为逐渐加重的头痛、且头痛剧烈、发热、恶心、呕吐、脑膜刺激征、面瘫、听力障碍、视力下降、听力减退、甚至失明、耳聋，随着病情的进展加重，可表现出意识障碍、精神障碍、癫痫、瘫痪、持续性高热。进入中枢神经系统的隐球菌荚膜多糖的累积使脑脊液(CSF)的黏性增高，形成微生物栓子，阻碍蛛网膜颗粒和淋巴管中CSF的重吸收[5]，导致颅内压升高，上述症状和高颅压密切相关，也可导致患者因脑疝死亡。

2 实验室检查

目前诊断隐球菌感染首先通过一般实验室检查和影像学检查进行初步筛查，再以检测隐球菌抗原抗体的免疫学检查进行诊断，而病理诊断仍为目前诊断隐球菌感染的金标准。分子生物学技术可对隐球菌进行基因分型等。但我们目前缺乏对隐球菌早期感染的特异性诊断方法，常导致临床隐球菌感染的漏诊。

2.1 病原体检查

墨汁染色法 迅速、简便、可靠。根据感染部位不同取所需检查的新鲜标本，如脑脊液、痰液、病灶组织或渗液等(脑脊液应离心后取沉淀涂片)，置于玻片上，加墨汁1滴，覆以盖玻片，在显微镜暗视野下找隐球菌，可见圆形菌体，外轴有一圈透明的肥厚荚膜，内有反光孢子，但无菌丝。在临床工作中，主要以脑脊液送检为主，痰液、粪便、胸腹水等也有检出。

真菌培养 取标本少许置于沙堡弱培养基中，在室温或37℃培养3～4 d可见菌落长出。

2.2 血清学检查

由于患者血清中可测到的抗体不多，因此检测抗体阳性率不高，特异性不强，仅作辅导诊断。通常检测新生隐球菌荚膜多糖抗原，以乳胶凝集试验敏感而特异，且有估计预后和疗效的作用。

现在乳胶凝集试验方法的很多产品因为无证而在临床中的应用受到了限制，如今更多的实验室采用的是新生隐球菌荚膜多糖检测试剂盒(ELISA)。

目前用于临床的隐球菌实验室检查主要分为病原学涂片和培养、免疫学及分子生物学检测方法。分子生物学技术在隐球菌分类、基因分型和诊断等研究中发展迅速，如染色体脉冲电泳、核酸探针技术、DNA指纹分类、聚合酶链反应(PCR)以及PCR结合其他技术等方法。

3 新生隐球菌在国内、外的研究现状

新生隐球菌感染是艾滋病患者常见的一种机会性感染，隐球菌的感染影响了艾滋病的疾病进程，隐球菌的多样性导致了HIV感染者治疗的难度，增加了HIV感染者的死亡率。在免疫缺陷的患者特别是HIV感染者中，脑膜炎的一个致命原因是隐球菌病，特别是在非洲和亚洲东南部，比起欧洲和北美，艾滋病相关的隐球菌病更常见[6]。对于健康人群来说，隐球菌性脑膜炎的发病率为0.15%，而对于艾滋病患者其发病率可高达6.5%[7]，也有资料表明，近年来发病率呈上升趋势[8]。在墨西哥，艾滋病患者中，中枢神经系统感染是机会性感染的第二大原因[9]。在不同地理区域的艾滋病患者中，隐球菌性脑膜炎仍然具有较高的死亡率[10，11]。

针对血清学分型、基因型分型及药敏试验方面，国内、外的同行也做了大量的研究工作。

血清学方面 新生隐球菌按血清学可分为A、B、C、D及AD5个血清型，包括3个变种：格鲁比变种(血清型A)；新生变种(血清型D、AD)；格特变种(血清型B、C)。血清型A、D和AD在世界范围内广泛分布，主要感染免疫缺陷人群(尤其是艾滋病患者)，血清D型较少引起隐球菌病，并且其中一些病例是由AD杂合体引起的[12]。1986年，Michael[13]自24例艾滋病并发新生隐球菌的病例中，将其证实为A、D或AD型。1987年，李竹青等[14]对中国致病性新生隐球菌血清型进行了研究，并得出结论，A型占大多数，有部分B型，D型、AD型及U型(不能分型)少见，无C型。血清型B和C，主要感染免疫正常的人群，主要分布于热带和亚热带地区的澳大利亚、亚洲、南非、加利福尼亚南部和欧洲南部，但自1999年以来，在加拿大英属哥伦比亚的Vancouver岛出现格特变种的爆发流行[15]。2015年，边富宁等[16]对广西贵港地区2009—2012年20株新生隐球菌进行血清学分析，20株有19株为新生隐球菌格鲁比变种，血清型为A型，a交配型，基因型为VNⅠ型。1株为格特隐球菌，属a交配型，基因型VGⅠ。

基因型方面 新生隐球菌有8种主要的基因型，即VNⅠ-VN Ⅳ和VGⅠ-VGⅣ，对应关系为VNⅠ和VNⅡ为格鲁比变种；VN Ⅲ为格鲁比变种和新生变种杂合体，VN Ⅳ为新生变种；VGⅠ-VG Ⅳ为格特隐球菌。而艾滋病患者合并隐球菌感染主要由新生变种和格鲁比变种引起。

2013年，戚建明等[17]对129株新生隐球菌基因型及感染人群进行研究，经过PCR(polymerase chain reaction)指纹分析和多位点序列分型(MLST，multilocus sequence typing)分析得到基因分型结果，新生隐球菌主要条带为VNⅠ型，但次要条带不同于已知VNⅠ各亚型，属于一种新的亚型，将其命名为VNⅠc。同年，Khayhan等[18]对中国86株新生隐球菌菌种结构的研究显示，中国华北、华东地区的新生隐球菌临床株以ST5型为主。2016年，郭鹏豪等[19]对广东地区25株新生隐球菌多位点序列分型，经过MLST分析显示，主要型别也为ST5型。经同源性比对，24株为VNⅠ型。2015年，Maestrale等[20]对引起脑膜炎的新生隐球菌和格特隐球菌变种进行基因和病理特征方面进行研究，经过多位点系列分析表明，格特隐球菌的基因型为AFLP4/VGⅠ，新生隐球菌的基因型为AFLP2/VNⅣ。

云南地区隐球菌的患者不在少数，却并没有临床分离株血清型、基因型相关研究的报道。云南地区新生隐球菌的研究主要如下：

2011年，张嗣兴等[21]对云南省传染病医院的艾滋病合并新生隐球菌患者耐药性研究表明，新生隐球菌对AMB和5FC非常敏感。

2014年、2016年，陶星辰等[22,23]对云南省大理、昭通、曲靖、临沧4个地区鸽粪中新生隐球菌的分离与鉴定结果表明，云南省地区鸽粪中新生隐球菌带菌率较高，且不同地区带菌率不同，并对新生隐球菌格鲁比变种进行微卫星分型分析。

2015年，张米等[24]对云南省传染病医院分离得到的155株新生隐球菌的药敏结果统计得到，新生隐球菌对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑的耐药率分别为0.6%、7.0%、9.6%。

2019年，樊红丽等[25,26]对艾滋病患者分离的新生隐球菌的药物敏感性以及云南省新生隐球菌的药物敏感流行病学折点进行了研究，发现在6种抗真菌药物中，新生隐球菌对伏立康唑和两性霉素B的耐药率为1.32%，5-氟胞嘧啶的耐药率为0.33%，未发现对伊曲康唑和氟康唑产生耐药的菌株；从云南省3家独立的实验室中共分离出324株新生隐球菌，其对6种常用抗真菌药物的流行病学折点为5-氟胞嘧啶8 μg/mL，泊沙康唑0.25 μg/mL，伏立康唑0.12 μg/mL，伊曲康唑0.25 μg/mL，氟康唑16 μg/mL，两性霉素B1 μg/mL。

我院虽然每年都能检出隐球菌临床分离株40株左右，但是目前的研究仅停留在分离鉴定及药物敏感性分析试验，这就要求咱们的工作人员能够更好地开展隐球菌的基础性研究。

4 展 望

我院作为艾滋病患者的定点收治医疗机构及全国首家省级艾滋病关爱中心，是卫生部艾滋病临床培训基地，开展全省艾滋病临床医生培训。在临床治疗过程中，艾滋病合并隐球菌病患者以颅压高、头痛为主要特征，也不排除同时患有隐球菌肺病，同时在诊治过程中发现隐球菌的复发率较高，根治率有待提高。

作为传染病医院的医生在收治艾滋病患者的同时，如患者有头痛、不明原因发热等相关症状一定要考虑隐球菌感染，反复多次送检相关标本(如脑脊液、痰液、胸腹水、粪便等)，确保送检的每一份样本符合送检要求以提高阳性率。

作为微生物实验室的工作人员，一定要具有相当高的敏锐性，对送检的每一份标本均要以阳性看待，在做好自己防护的同时，积极改进方法、积累经验，提高阳性检出率，为临床早发现、早治疗提供依据。