白念珠菌生物被膜的研究进展

华可心 于淑颖,2 徐英春

(1.中国医学科学院北京协和医院检验科 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室,北京 100730; 2.中国医学科学院北京协和医学院,北京 100730)

白念珠菌是一种机会性致病真菌，也是引起真菌血症和播散性念珠菌病的主要病原体[1]。白念珠菌定植于人体的皮肤和黏膜等部位，当机体的正常防御功能受损时，如创伤、营养失调、免疫功能缺陷、激素和抗生素的应用导致菌群失调等[2]，白念珠菌会过度生长，从口腔、咽喉和生殖道等浅表黏膜感染转变为循环系统、骨骼和大脑的全身性侵袭性念珠菌病[3]。白念珠菌常以生物被膜的形式生长在植入体内的生物材料上，比如中心静脉导管、导尿管、心脏起搏器和其他与器官直接接触的材料。白念珠菌的生物被膜能有效地抵御机体免疫力和抗真菌药物，诱导白念珠菌耐药性的增加，从而导致临床治疗困难。本文综述了白念珠菌生物被膜的形成、耐药机制及其相关感染治疗方法的研究进展。

1 白念珠菌生物被膜

白念珠菌生物被膜是由丝状细胞和酵母细胞组成、细胞外基质包被的复杂生物群落，细胞外基质增强了细胞的增殖能力和对抗真菌药物的耐药性。在全球范围内，白念珠菌生物被膜的感染主要导致医用生物材料相关性念珠菌病，具有很高的死亡率和发病率[4]。临床医生在治疗侵袭性念珠菌病过程中遇到的主要问题，是白念珠菌生物被膜会在使用强抗真菌药物时显示出耐药性，导致治疗无法进行。此外，白念珠菌基因组的可塑性使其具有微进化和宿主适应性等优势[5]。因此，白念珠菌生物被膜的形成过程和耐药机制等研究，对于研发新型抗真菌药物的和探索非传统抗真菌药物对白念珠菌生物被膜的疗效至关重要。

2 白念珠菌生物被膜的形成过程

白念珠菌生物被膜是由细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)包裹酵母细胞、菌丝细胞和假菌丝细胞组成的致密的网状系统，呈有机的三维结构和广泛的空间不均一性，ECM具有保护作用[6]。生物被膜相关感染，治疗非常困难，临床上分离的白念珠菌生物被膜的毒力更强，增加了患者的死亡率[7,8]。

在白念珠菌生物被膜的形成过程中，可分为4个阶段:①黏附；②起始(也称增殖)；③成熟；④分散。通常在24～48 h内按顺序进行[6,9]。10个早期黏附相关基因中，ALS1、ALS2、ALS3、EAP1和MSB2基因已被证明是生物被膜形成的必要基因[10]。在黏附过程中，单个酵母细胞黏附在物体表面，启动生物被膜形成阶段。此时的酵母细胞还可以重新回到浮游状态，所以在这个阶段，生物被膜的形成是可逆的。在起始阶段，酵母菌繁殖形成微菌落，微菌落融合构成生物被膜的基底层，分裂的酵母细胞开始形成假菌丝和菌丝细胞，并在整个生物被膜形成过程中继续伸长和增殖，侵入宿主或植入的生物材料表面[11]。形成生物被膜的核心调控因子，例如Efg1、Ndt80、Rob1和Tec1也参与调控浮游细胞的菌丝生长，上述任何的基因缺失都可以减少甚至消除菌丝的形成。在生物被膜成熟过程中，菌丝是白念珠菌生物被膜发育的支架，支撑着生物被膜的不同组成部分，有助于生物被膜整体结构的稳定性。临床分离株的转录谱研究表明，与形成较薄生物被膜的菌株相比，较厚生物被膜的菌株具有HWP1等菌丝特殊基因的高表达[12]。随着菌丝的产生，多糖会不断分泌ECM。白念珠菌生物被膜的ECM是复杂的。多糖主要包括甘露聚糖、β-1,6葡聚糖和β-1,3葡聚糖[13]。尽管β-1,3葡聚糖是次要成分，但它与生物被膜的耐药性有关，并阻止药物扩散[14]。在扩散阶段，单个酵母细胞从成熟生物被膜的菌丝中释放出来，重新变成浮游状态，然后继续传播到其他宿主，开始1个新的生物被膜形成周期，从而造成传播感染。转录调控因子Ume6、Nrg1和Pes1(也称为Nop7)都与扩散有关，NRG1或PES1的过表达增加了生物被膜释放的细胞数量，而Ume6的过表达可以减少扩散[15,16]。

3 白念珠菌生物被膜的耐药机制

对于白念珠菌的治疗目前有四类主要的抗真菌药物被用于治疗大多数真菌感染:唑类、多烯类、棘白菌素和嘧啶类。而白念珠菌的生物膜对大多数已知的抗真菌药物，具有固有的耐药性如唑类和多烯类对白念珠菌的生物膜无效。白念珠菌生物被膜耐药性是多种因素和机制共同作用的结果，目前对生物被膜耐药机制的研究主要有以下3个方面：

3.1 外排泵

白念珠菌介导药物流出的主动外排系统有两大类：ATP结合盒超家族(ATP binding cassette, ABC)和主要易化子超家族(the major facilitator, MFS)。前者与耐药相关的基因主要是CDR1与CDR2编码的转运蛋白，而后者主要是由MDRl基因编码的转运蛋白，通过膜中H+的交换来转运底物，属非能量依赖型载体。在浮游细胞中，外排泵通常在抗真菌药物的作用下上调，然而在生物被膜中，即使在没有抗真菌药物的情况下，它们在黏附的最初几个小时内上调，并在整个生物膜发育过程中保持上调。SHI等[17]通过临床分离了23株白念珠菌分离株，采用结晶紫分析法监测生物膜的生长，运用RT-PCR对转运体相关基因MDR1、CDR1、CDR2以及ERG11(编码抗真菌药物靶向酶的基因)的表达的进行量化，实验结果表明氟康唑可以在早期诱导外排泵编码基因在生物膜形成中的过度表达。虽然在生物膜和浮游细胞中加入氟康唑后，ERG11在生物膜中没有上调，但ERG11出现过表达。外排泵编码基因的上调表明了它们在白念珠菌生物膜形成早期对氟康唑耐药性的形成过程中发挥的作用。TAC1为ABC转运蛋白关键调控因子，TACl基因GOF突变可导致生物被膜耐药外排泵相关的基因CDR1、CDR2过度表达导致白念珠菌细胞内的药物泵出细胞外，从而达不到药效浓度[18]。

3.2 细胞外基质

基质既是生物膜整体结构的稳定剂,又是药物穿透的物理屏障。生物膜耐药的主要决定因素之一是细胞外基质中的甘露聚糖-葡聚糖复合物[19]。细胞外基质中的β-1,3葡聚糖与生物被膜的耐药性有关，Tan等在研究中，通过评价了β-1,3-葡聚糖酶的抗生物膜活性，发现β-1,3-葡聚糖酶可以降解白念珠菌生物膜中的β-1,3-葡聚糖。生物膜的分散率为55.96%。β-1,3-葡聚糖酶对浮游念珠菌的生长和黏附没有影响，β-1,3-葡聚糖可以明显增强了氟康唑和两性霉素B的抗真菌药敏性。激光共聚焦扫描显微镜和扫描电镜检查证实了β-1,3-葡聚糖酶的抗生物膜活性。研究结果表明，特异性靶向或酶法降解生物膜基质可能是对抗白念珠菌生物膜的有效新疗法[14]。

3.3 持留细胞

持留细胞是导致白念珠菌生物膜耐药的另一因素，持留细胞是真菌生物膜内的小亚群，对高浓度的抗真菌物质有抗性。当在生物膜内出现表型变异，对抗真菌药物具有极强的耐药性。持留细胞存在休眠状态，可以帮助它对抗两性霉素B[20]。虽然对白念珠菌生物膜中持留细胞的形成和发育了解的很少，但我们知道持留细胞的耐药性与细胞膜的成分和射流泵基因表达存在区别,是细胞的新陈代谢休眠状态的结果。持留细胞如何机械性调控的作用机制，可能是未来开发新的治疗方法来阻止它们形成或存活的关键。[21]

4 抗白念珠菌生物被膜的药物的研究进展

4.1 非抗真菌药物与传统真菌药物联合使用对抗白念珠菌生物被膜的研究进展

2016年Li等[22]通过临床分离的白念珠菌生物膜体外构建生物膜模型，荧光染色法观察生物膜的生长和形态，XTT法测定药物对生物膜型白念珠菌细胞活性的影响，RT-PCR的方法测定黏附基因ALS3、HWP1和外排泵基因CDR1和MDR及细胞壁相关基因ERG11的mRNA表达量的变化。最终实验结果表明钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A能够增强生物被膜型白念珠菌药物对氟康唑的敏感性。2017年Li等[23]研究发现盐酸氨溴索可以通过抑制药物转运蛋白，增加氟康唑的吸收并减少其外流。结果表明氟康唑和盐酸氨溴索联合使用对不同时期耐药的白念珠菌生物被膜具有协同作用。盐酸氨溴索和氟康唑在体内外的联合使用均使白念珠菌的耐药性产生逆转。这两种药物的组合可能成为治疗白念珠菌耐药性的潜在治疗方法。2020年Jhones等[24]研究表明ToAP2和NDBP-5.7肽对白念珠菌浮游生物膜和生物膜具有活性。经过实验得出ToAP2肽与氟康唑和两性霉素B的具有协同作用。

4.2 白念珠菌生物被膜新型物质的研究进展

白念珠菌生物被膜的形成常会危及生命很难根除。目前的抗真菌治疗对生物被膜的形成影响很小，没有有效的解决方案。随着耐药性的增强进一步阻碍了抗真菌药物的疗效。近年来，一些体外实验提示有些药物，可以成为治疗白念珠菌生物被膜感染的有效手段。

多项研究表明地衣酸是苔藓的次要代谢产物，可抑制不同细菌和真菌的生长，然而其抗菌作用机制仍不清楚。Mriana等[25]通过研究白念珠菌生物被膜中的细胞应激和抗氧化反应，发现地衣酸可以改变氧化-抗氧化平衡，可能是导致细胞不可逆损伤和细胞死亡的原因。研究结果表明，地衣酸可以作为治疗念珠菌感染的一种替代药物，值得进一步研究。

檞皮素(QCT)是指一种膳食类的黄酮，已被证明对白念珠菌生物被膜具有抑制作用。对于引起外阴阴道念珠菌病(VVC)的白念珠菌，其生物被膜是导致氟康唑(FCZ)耐药的重要因素之一。Mei等[26]展开了QCT和FCZ对白念珠菌生物被膜抑制作用的研究，在实验中，QCT和FCZ同时使用可以抑制VVC中生物被膜酵母向菌丝的转化，显示QCT具有与FCZ的协同作用和良好的抗真菌作用，可用于白念珠菌生物被膜致VVC的临床治疗中。

光动力学灭活对氟康唑耐药的白念珠菌生物被膜具有抑制作用。Lucia等[27]利用红色激光照射被亚甲蓝处理的对氟康唑耐药的白念珠菌生物被膜进行光动力学灭活(PDI)研究证明:① PDI对生物被膜有效；②复合菌丝形成的生物被膜与酵母菌形成的生物被膜在敏感性上存在差异，酵母菌形成的生物被膜更为敏感；③PDI对氟康唑耐药菌株形成的生物被膜有效。

CHEN等[28]研究法尼醇通过调节环AMP(CAMP信号通路)抑制菌丝生长，CYRI和PDE2调节一对直接负责CAMP合成和降解的酶。法尼醇对白念珠菌生物膜具有潜在的抗真菌活性。通过实验表明CYRI和PDE2可提高白念珠菌生物膜的抗真菌能力。法尼醇通过调控CYRI和PDE2基因的表达来抑制白念珠菌生物膜的抗真菌作用。

5 小 结

白念珠菌生物膜在临床留置装置上定植，是导致血源性感染的重要因素。由于白念珠菌生物被膜形成过程和耐药机制的复杂性，且对许多传统的抗真菌药物天然耐药，本文介绍非真菌药物与真菌药物联合应用以及新型抗真菌药物的研究进展，为白念珠菌生物被膜引起的难治性院内感染提供了新思路。