铅胁迫对薏苡种子萌发和幼苗生理特性的影响

钟 静， 张瑶心， 李景蕻， 陈功轩

(湖北第二师范学院化学与生命科学学院，植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室， 武汉 430205)

土壤为植物生长提供必需的生活条件，是动物生存的自然环境[1]。但是随着工业化进程的迅猛发展，我国土壤重金属污染问题日益严重，其中铅是最常见的一种重金属污染物[2]。土壤中的铅主要来源于锌矿开采中废液废气的排放、农药和化肥的滥用、含铅汽油的使用等[3]。铅不易代谢和降解，土壤中的铅可被植物根系吸收并在体内积累，扰乱植物正常的生理过程，最终对植物产生严重的毒害作用[4]。此外，通过食物链，铅进入人体后对机体的神经、心血管、泌尿和内分泌等多个生理系统造成危害，甚至导致铅中毒[5]。

薏苡(Coixlachrymal-jobiL.)是禾本科薏苡属的草本植物，是我国一种传统的药食两种作物[6]。薏苡种仁在我国传统医学中是一种常用的利水渗湿药材[7]。近年研究发现，从薏苡仁中提取的薏苡仁油不仅可以杀死癌细胞，还能显著提高机体的免疫功能[8]。目前，关于铅胁迫对植物生长发育影响的研究较多，但是薏苡属植物对铅胁迫生理响应的研究还未见报道。本试验以薏苡仁为研究材料，检测了不同铅胁迫程度对薏苡种子萌发和幼苗生长的影响；通过比较不同浓度硫酸铅条件下薏苡幼苗叶片丙二醛(MDA)和脯氨酸含量、SOD活性、相对电导率、叶绿素和类胡萝卜素含量来深入分析铅胁迫对薏苡幼苗生理活动的作用，以期为薏苡种植过程中预防铅伤害提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料购自湖北省黄冈市蕲春县种植的薏苡种子。去除干瘪种子后，选取大小均匀的种子备用。

1.2 硝酸铅处理实验

消毒薏苡种子浸泡于75%乙醇中15 min，无菌水冲洗5次。灭菌滤纸吸干种子表面水分后均匀放于发芽床。发芽床为内垫双层灭菌滤纸的培养皿(直径12 cm)。将不同浓度的硝酸铅溶液倒入皿中至滤纸饱和。发芽床置于25 ℃、2 000 lx光照强度、12 h/12 d光照周期下进行萌发和生长培养。每天更换溶液，设置硝酸铅浓度为：0(ck)、15、30、45、60 mg·L-1。实验重复3次，每个处理浓度至少100粒薏苡种子。

1.3 测定指标

1.3.1萌发指标

种子发芽以胚根生长至种子长度的一半为准。从培养第2天开始逐日统计种子发芽数。参考王玺等[9]的方法，按照下列公式计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数：

发芽率(%)=(10 d内发芽种子数/实验种子总数)×100%；

发芽势(%)=(4 d内发芽种子数/实验种子总数)×100%；

发芽指数=∑第10天发芽数/10 d；

活力指数=发芽指数×苗高。

1.3.2幼苗生长指标

培养10 d后，从不同处理浓度的萌发幼苗中各随机选取15株，测定幼苗主根根长和苗高。

1.3.3生理生化指标的测定

取培养第10天的幼苗叶片进行生理生化指标的测定。参考王学奎[10]的方法测定相对电导率，叶绿素和类胡萝卜素含量(采用乙醇提取法测定)；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[11]测定；参考彭昌琴等[12]的方法测定脯氨酸含量；参考吴晓敏等[13]的方法测定SOD活性。

1.4 数据处理

用SPSS 19.0软件和Excel 2010软件进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 铅胁迫对薏苡种子萌发的影响

比较不同浓度硝酸铅对薏苡种子萌发的影响，未添加硝酸铅的对照组种子发芽率达80%，中高浓度的硝酸铅抑制种子的发芽。60 mg·L-1硝酸铅处理后，种子发芽率降至55.56%，发芽率降低了近1/3(表1)。对照组种子发芽势为66.55%，30 mg·L-1硝酸铅处理后发芽势开始出现明显下降。当硝酸铅浓度升至60 mg·L-1后，发芽势为44.44%，与对照组相比降低了22.11%(表1)。硝酸铅对发芽指数的影响与前两者相似，15 mg·L-1低浓度硝酸铅对其并无明显影响，随着硝酸铅浓度的升高发芽指数逐渐降低(表1)。但即使是低浓度硝酸铅处理，活力指数仍出现明显下降，从对照组的47.14%降至32.94%。当硝酸铅浓度升至60 mg·L-1后，活力指数比对照组降低了36.22%(表1)。

表1 铅胁迫对薏苡种子萌发的影响Table 1 Effects of lead stress on seed germination of C. lacryma

2.2 铅胁迫对薏苡幼苗生长的影响

硝酸铅不仅抑制种子萌发，还严重影响萌发幼苗的生长。由表2可知，在持续的铅胁迫中，薏苡幼苗的主根和苗高都明显短于对照组。未添加硝酸铅的幼苗苗高和主根分别可达8.30 cm和8.61 cm。添加15mg·L-1硝酸铅后，苗高和主根长迅速降至5.93 cm和4.20 cm。随着硝酸铅浓度的升高，对幼苗生长抑制作用越显著。当硝酸铅达到60 mg·L-1时，主根长仅0.52 cm，与对照组相比其生长几乎完全被抑制；此时苗高也受到明显抑制，但是仍有2.8 cm。可见铅胁迫对幼苗主根的影响高于对苗的影响。

表2 铅胁迫对薏苡幼苗生长的影响Table 2 Effects of lead stress on seedling growth of C. lacryma

2.3 铅胁迫对薏苡幼苗叶片叶绿素和类胡萝卜素含量的影响

对不同浓度硝酸铅处理后薏苡萌发幼苗叶片叶绿素和类胡萝卜素进行了测定。结果表明，硝酸铅处理后叶绿素含量降低。15 mg·L-1硝酸铅处理对叶片中叶绿素a含量的影响较小，从对照组的1.64 mg·g-1降至1.56 mg·g-1，降幅为4.88%；此时，叶绿素b含量从0.55 mg·g-1降至0.49 mg·g-1，降幅(10.91%)高于叶绿素a(图1)。30 mg·L-1硝酸铅处理后，叶绿素a和叶绿素b含量分别为1.44 mg·g-1和0.43 mg·g-1。60 mg·L-1硝酸铅处理后，叶绿素a和叶绿素b含量分别为1.11 mg·g-1和0.30 mg·g-1，降幅分别为32.32%和45.45%(图1)。硝酸铅处理也导致叶片中类胡萝卜素含量的降低。15 mg·L-1硝酸铅处理后，类胡萝卜素含量即从对照组的1.23 mg·g-1降至1.05 mg·g-1，降幅达14.63%，明显高于叶绿素a的降幅。45 mg·L-1硝酸铅处理后，类胡萝卜素含量降低至0.66 mg·g-1，降幅为对照组的46.34%。60 mg·L-1的硝酸铅处理后，类胡萝卜素含量大幅下降到0.37 mg·g-1，降幅高达69.92%(图1)。

2.4 铅胁迫对薏苡幼苗叶片MDA含量的影响

测定了不同浓度硝酸铅处理后叶片中MDA含量。结果显示，MDA含量随着硝酸铅浓度的升高而逐渐增加(图2)。对照组中MDA含量较低，仅28.46 μmol·g-1。添加低浓度(15 mg·L-1)硝酸铅后，MDA含量微弱上升至30.35 μmol·g-1。30 mg·L-1硝酸铅处理后，MDA含量升高至32.86 μmol·g-1，与对照组相比增加了15.46%。45 mg·L-1硝酸铅处理后，MDA增至39.1 μmol·g-1，比对照增加了37.39%。60 mg·L-1硝酸铅处理后，MDA含量为43.28 μmol·g-1，比对照增加了52.07%(图2)。

2.5 铅胁迫对薏苡幼苗叶片相对电导率的影响

同时还对硝酸铅处理后叶片的相对电导率进行了测定。由图3可知，铅胁迫引起相对电导率的逐渐升高。但是中低浓度硝酸铅(15 mg·L-1和30 mg·L-1)对相对电导率的作用较小。当硝酸铅浓度升至45 mg·L-1后，相对电导率开始出现明显上升，从对照组的35.65%升至45.27%。当硝酸铅浓度升至60 mg·L-1后，相对电导率升至49.13%，与对照组相比升高幅度为37.81%。

2.6 铅胁迫对薏苡幼苗叶片SOD活性的影响

对不同浓度硝酸铅处理后薏苡萌发幼苗叶片中SOD的测定，由图4可知，中低浓度硝酸铅处理对叶片中SOD活性有轻微促进作用。当硝酸铅浓度升至45 mg·L-1后，SOD活性开始下降，从对照组的398.33 U·g-1降至365.87 U·g-1，降幅为8.15%。当硝酸铅浓度升至60 mg·L-1后，SOD活性降至321.65 U·g-1，分别比对照组和45 mg·L-1硝酸铅处理组降低19.25%和12.09%，降幅较为明显。

2.7 铅胁迫对薏苡幼苗叶片脯氨酸含量的影响

对不同浓度硝酸铅处理条件下，薏苡萌发幼苗叶片中脯氨酸含量测定结果显示，15 mg·L-1硝酸铅处理对叶片中脯氨酸含量的影响并不十分显著，从对照组的40.06 μg·g-1升至44.01 μg·g-1，仅增加7.18%。当硝酸铅浓度升至30 mg·L-1后，脯氨酸增幅开始出现明显变化，且硝酸铅浓度越高脯氨酸含量增加越明显(图5)。45 mg·L-1硝酸铅处理后，脯氨酸含量升至58.62 μg·g-1，升高比例为42.77%。60 mg·L-1硝酸铅处理，脯氨酸含量攀升至74.42 μg·g-1，升高比例高达81.25%(图5)。

3 讨 论

铅并不是植物必需的微量元素，相反它对动植物都具有很大的毒性[14]。植物对铅胁迫的响应是通过多种途径的。本实验主要通过比较不同浓度硝酸铅处理条件下，薏苡种子萌发和幼苗生长的差异来探讨铅胁迫对薏苡生理活动的影响。

研究表明，低浓度(15 mg·L-1)硝酸铅对薏苡种子的发芽率、发芽势和发芽指数并无明显抑制效果，对活力指数的抑制影响十分显著。但是薏苡种子的这4个萌发指标受中高浓度(30～60 mg·L-1)硝酸铅的影响呈现明显的抑制效应(表1)。这说明薏苡种子对铅胁迫具有一定的抗性。铅胁迫程度的加深可能破坏了种子萌发所必须的生理条件，因此表现出对种子萌发的抑制。此外，即使是低浓度硝酸铅处理，幼苗主根和苗高显著短于未进行铅胁迫的对照组。说明薏苡幼苗生长对于铅胁迫十分敏感。同时还观察到，铅胁迫对幼苗主根的抑制效果要明显高于苗高，这可能是由于种子内含的营养物质足够支撑自身萌发，所以低浓度铅胁迫对其影响很小，但是萌发之后，幼苗生长所需要的物质很多都需要通过根从外部环境中吸收。铅在幼苗体内首先会在根中积累，随后才被运输至叶片中，因此首先受到毒害的部位是根，随后才是地上部分。随后对叶绿素和类胡萝卜素含量进行了测定。尽管低浓度硝酸铅处理能够在一定程度上降低叶绿素a的含量，但是变化并不显著。低浓度硝酸铅处理后，叶绿素b和类胡萝卜素降幅分别为10.91%和14.63%，明显高于叶绿素a。高浓度(60 mg·L-1)硝酸铅处理后，叶绿素a和叶绿素b降幅分别为32.32%、45.45%，而类胡萝卜素降幅则高达69.92%(图1)。这表明在薏苡幼苗叶片中，类胡萝卜素的生成对铅胁迫的敏感性高于叶绿素。植物利用叶绿素进行光合作用，本研究结果说明硝酸铅可能通过降低植物对光的吸收和转化，从而影响薏苡幼苗的生长。

膜脂过氧化的主要产物是MDA，因此机体内MDA的积累在一定程度上反映了植物受伤害程度[15]。在本实验中，低浓度硝酸铅处理后，薏苡幼苗叶片中MDA含量并无明显变化(图2)。这有可能是因为此时叶片中积累的铅含量还比较低，对细胞膜完整性的影响较小。但是，中高浓度硝酸铅处理后，叶片中MDA含量随硝酸铅浓度的增加而逐渐上升。尤其在60 mg·L-1硝酸铅处理后，叶片中MDA含量增至对照组的1.5倍(图2)。这可能是随着硝酸铅浓度的增加，铅被不断运输至叶片并积累，对质膜的损害作用逐渐呈现。质膜完整性被破坏，细胞膜选择透性丧失，会导致细胞内电解质的外渗，引起相对电导率的上升[16]。本研究检测了硝酸铅处理后薏苡幼苗叶片相对电导率的变化，发现其随着铅胁迫程度的加深而升高。其中，中低浓度(15 mg·L-1和30 mg·L-1)硝酸铅处理后相对电导率的上升十分微弱；当硝酸铅浓度升至45 mg·L-1后，相对电导率开始出现显著变化(图3)。

SOD是机体内负责清除氧自由基的一种保护酶[17]。与对照组相比，中低浓度的硝酸铅可以微弱的促进叶片中SOD活性。但是当硝酸铅浓度持续升高后，叶片中SOD含量开始显著降低(图4)。此外，本实验发现低浓度的硝酸铅处理对脯氨酸含量的影响并不显著；但是当硝酸铅浓度提高到30 mg·L-1后，脯氨酸含量随处理浓度的升高而显著升高(图5)。脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质。本实验结果表明，薏苡幼苗可能通过多种途径来抵抗铅胁迫，如通过提高SOD酶活性来抵抗逆境下产生的过量氧自由基，从而实现保护自身的作用。但是随着铅胁迫程度的不断升高，毒害作用逐渐加深、机体的许多生理过程遭到破坏，其中必然包括保护酶类合成过程，因此SOD酶活性不断下降；同时叶片通过提高脯氨酸含量，为细胞提供足够的自由水、防止蛋白质脱水变性，以维持正常的生命活动。