卵叶海桑花粉活力测定方法的比较研究

任飞艳， 陈 显， 王士泉

(热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南省热带动植物生态学重点实验室，海南师范大学生命科学学院， 海口 571158)

卵叶海桑(SonneratiaovataBacker)隶属于海桑科海桑属，生长于热带、亚热带海岸潮间带，主要分布于泰国、越南、马来西亚、印度尼西亚以及巴布亚新几内亚等地[1-3]。我国仅天然分布于海南省文昌市清澜港自然保护区，分布范围狭窄，天然更新困难，被列为濒危物种[2,4]。目前国内外对卵叶海桑的研究较少，主要集中在化学成分[5-7]、遗传多样性[8-9]、染色体核型[10-11]、育苗技术[12]、形态解剖[13-16]等方面。卵叶海桑具有抗风、耐贫瘠、耐盐碱等特点，是理想的海防林树种。

卵叶海桑生长地在人为因素和自然因素的共同作用下，生态系统日渐脆弱，抵御外界干扰的能力降低，自然更新相对困难，个体数量也在不断减少。前期调查表明，在卵叶海桑林下无幼苗生长。卵叶海桑通过种子繁殖，但在自然条件下，种子发芽率极低，影响了其自然更新。研究表明，拟海桑的花粉败育率为95.62%，海南海桑为54.43%，这会影响开花时期的有效传粉和授粉过程，导致结实率低和种子量少[17]。本文以卵叶海桑花粉为实验材料，利用TTC染色法、MTT染色法、亚历山大染色法、I2-KI染色法、红墨水染色法和离体萌发法，测定卵叶海桑的花粉活力，确定卵叶海桑花粉活力快速有效的测定方法，为下一步探讨卵叶海桑濒危的原因，进行传粉、繁育系统研究和杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

卵叶海桑是常绿乔木，高4～8 m。花序顶生，花1～3朵，无花瓣，萼管表面具明显的小瘤状突起，花萼片内面红色。2019年3—6月，在海南省文昌市清澜港自然保护区，选取初花期未散粉的花朵，待花药裂开，花粉自然散出后，采用6种不同的方法测定花粉活力。

1.2 方 法

1.2.1TTC染色法[18]

用镊子取花粉散落到试管里，滴1～2滴0.5%的TTC染液，搅拌均匀后，置于37 ℃恒温箱中，避光染色2～3 h。将玻片置于显微镜下观察并统计有活力和无活力的花粉数。具有活力的花粉被染色后呈红色，发育不良活力弱的花粉无法着色。

1.2.2MTT染色法[19]

用镊子将花粉置于载玻片上，滴1～2滴5%的MTT染液染色(MTT有致癌性，使用过程应佩戴手套)，置于25 ℃恒温箱中，避光染色1～2 h。然后将玻片置于显微镜下观察并统计有活力和无活力的花粉数。凡是具有活力的花粉被染色后呈蓝紫色，发育不良生活力弱的花粉呈黄褐色。

1.2.3亚历山大染色法[20]

用镊子将花粉置于载玻片上，滴1～2滴亚历山大染液染色，盖上盖玻片，室温染色，将玻片置于显微镜下观察并统计有活力和无活力的花粉数。凡是具有活力的花粉，原生质呈红色，花粉壁呈绿色；原生质和花粉壁均呈绿色则为发育不良或无活力。

1.2.4I2-KI染色法[21]

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用镊子将花粉置于载玻片上，加1～2滴I2-KI染液，盖上盖玻片，室温染色，将玻片置于显微镜下观察并统计有活力和无活力的花粉数。凡具有生活力的花粉粒被染色后呈蓝黑色(其中含有积累的淀粉)，发育不良或无活力的花粉粒呈黄褐色。

1.2.5红墨水染色法[22]

用镊子将花粉置于载玻片上，加1～2滴红墨水染液，盖上盖玻片，室温染色，将玻片置于显微镜下观察并统计有活力和无活力的花粉数。凡是具有活力的花粉呈无色，发育不良活力弱的花粉呈红色。

1.2.6离体萌发法[23-24]

用镊子将花粉置于双凹载玻片上，加1～2滴蔗糖-硼酸培养液(10%蔗糖，10 mg·L-1硼酸，0.5%琼脂)，将载玻片置于培养皿内，盖上盖玻片，置于25 ℃恒温箱中，培养后将玻片置于显微镜下观察，统计有生活力和无生活力的花粉数。

1.3 数据统计与分析

每株设3次重复，每次取10余个视野观察。每个个体统计的花粉数都在500粒以上。采用Excel 2007软件和SPSS 19.0分析软件对相关数据进行统计比较分析。在USB数码显微镜下放大40×或10×拍照保存并处理图像。

2 结果与分析

2.1 TTC染色法测定花粉活力

TTC是一种无色的氧化还原染料，氧化状态下是无色的。具有活力的花粉呼吸作用强烈，脱氢酶能将无色的TTC还原为红色的TTF。没有活力的花粉不具有上述功能。有活力的花粉被染成红色，而无活力的花粉不能着红色(图1 A)。TTC染色法多次实验未果，花粉活力均为0，表明TTC染色法不适合用来测定卵叶海桑的花粉活力(表1)。

2.2 MTT染色法测定花粉活力

MTT是一种能接受氢原子的染料，外源性的MTT还原生成难溶性并沉淀的蓝紫色结晶物质，而死细胞没有此功能。MTT染色法根据花粉粒中脱氢酶的活性确定花粉生活力，凡被染成蓝紫色的为活力较强的花粉，呈黄褐色为发育不良的花粉，无色为无活力的花粉(图1 B)。MTT染色法测定的卵叶海桑花粉活力为88.00%～90.40%，平均为89.30%(表1)。

表1 不同方法测定的花粉活力Table 1 Pollen viability measured by different methods

2.3 亚历山大染色法测定花粉活力

2.4 I2-KI染色法测定花粉活力

利用I2-KI溶液对花粉粒进行染色，淀粉遇碘后变成蓝色，花粉粒中淀粉含量直接影响花粉的着色程度，并成为判断花粉活力高低的依据。有活力的花粉淀粉含量高，被染成蓝色，而无活力的花粉淀粉含量少，呈黄褐色(图1 D)。 I2-KI染色法测定的结果为83.20%～92.60%，平均为89.35%(表1)。

2.5 红墨水染色法测定花粉活力

利用红墨水对花粉粒进行染色，有活力的花粉其细胞膜具有选择透性，无活力的花粉具有完全渗透性，因此未被染色的花粉粒是具有生活力的，呈红色的为发育不良活力弱的花粉(图1 E)。红墨水染色法测定的结果为79.40%～87.00%，平均为83.22%(表1)。

2.6 离体萌发法测定花粉活力

卵叶海桑的花粉粒为椭圆形，未萌发时呈黄色，在25 ℃避光培养30 min后，有活力的花粉粒开始出现透明突起，随后在2～3 h期间逐渐伸长形成花粉管(图1 F)。以花粉管的长度大于花粉粒直径作为萌发标准，统计其萌发状况，计算出花粉活力。离体萌发法测得的萌发率为81.20%～93.40%, 平均值89.11%(表1)。

2.7 不同测定方法花粉活力的比较

红墨水染色法的结果低于离体萌发法，二者在5%水平上差异显著(p<0.05)，在1%水平上差异极显著(p<0.01)。MTT染色法和I2-KI染色法的结果略高于离体萌发法，亚历山大染色法的结果略低于离体萌发法，三者与离体萌发法的结果在5%水平和1%水平上差异均不显著(表2)。

表2 5种方法测定的卵叶海桑花粉活力比较Table 2 Comparison of pollen viability of S. ovata measured by 5 methods

而TTC染色法的花粉活力均为0，多次实验未果，故在此不进行比较分析。

3 讨论与结论

本实验结果表明，利用离体萌发法测得的花粉活力较高。对于培养温度、营养成分、pH值要求较高，花费时间长，不太适合快速准确地测定花粉活力，但可将该方法作为标准，确定哪种方法更适合卵叶海桑花粉活力的测定。

TTC染色法已广泛用于许多植物花粉活力的测定，但其对花粉要求较高，当花粉中脱氢辅酶含量较低时，就难以准确地测定花粉活力[25]。本实验中，TTC染色法对卵叶海桑花粉的染色效果不佳，可能与材料选择有关，花粉均呈淡红色，颜色深浅差异不明显，很难区分其是否被染色，TTC无法成功染色的原因有待进一步研究。MTT染色法操作要求较高，实验过程复杂，且需要在避光环境下进行操作，所以MTT不适合快速准确测定花粉活力。红墨水染色法的优点是简便，时间也较短，适于野外测定，但随时间的延长多数花粉逐渐失去选择透性，如不及时统计可能会降低实验结果的准确性。亚历山大染色法染色效果较好，在室温下放置一段时间就可以观察结果且易辨别，适用于野外条件下花粉活力的快速测定，结果也比较接近离体萌发法。I2-KI染色法主要是依据花粉粒内的淀粉判断花粉活力，决定性因素是淀粉含量的高低，主要适用于玉米、小麦等淀粉含量比较高的农作物花粉活力测定[26]。从本实验的测定结果看，I2-KI染色法所测得的花粉活力最高，接近于离体萌发法的结果。I2-KI染色法是一种经济、快速测定花粉活力的方法，适合野外条件下花粉活力的检测。

综上所述，I2-KI染色法和亚历山大染色法都可以快速、准确地检测出卵叶海桑的花粉是否有活力以及活力的高低，是判断花粉活力的简便准确方法，可为传粉、繁育系统研究和杂交育种提供科学依据。