山蚂蝗属种质芽期和苗期耐盐性鉴定和评价

严琳玲， 虞道耿， 郇恒福， 王文强

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室， 海南 儋州 571737)

土壤盐碱化不仅影响生态环境，还会使植物的形态外观发生改变，并导致植物体内的生理生化发生紊乱，从而造成减产或发生病虫害[1]。我国盐碱地面积9 000万hm2[2]，且面积还在不断增加[3]。虽然可通过一些工程措施或者化学措施对盐碱地进行改良，但成本较高且效果不明显，容易复发[4]。因此，选育耐盐品种将成为盐碱地改良和利用的一项重要举措[5]。

山蚂蝗属(DesmodiumDesv.)植物是热带及亚热带地区重要的豆科牧草之一[6]，主产于我国海南、云南及广东等热带亚热带地区。山蚂蝗鲜草产量较高，且营养价值丰富，常被用作青饲喂养鸭、鹅等家禽及牛、羊等牲畜[7]；由于其耐盐、耐干旱，可与恶性杂草共存，因此也被用作绿肥间作幼龄果园及胶园[8]。此外，山蚂蝗植物还含有一些黄酮类物质及生物碱类物质，具清热利湿、消炎止痛等功效，也常被作为药物提取[9]。

由于植物在不同的生长发育时期对逆境的敏感性都不一样，而芽期和苗期是植物在生长发育过程中对盐胁迫等逆境反应较为敏感的时期[10]。因此，本试验对6份山蚂蝗属种质芽期和苗期的耐盐性进行探讨，以期筛选出芽期及苗期耐盐种质，进而为培育耐盐山蚂蝗新品种提供理论依据。

1 材 料

6份山蚂蝗均取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草备份库，名称及来源详见表1。

表1 供试种质材料来源Table 1 Sources of tested germplasms

2 试验设计

2.1 山蚂蝗属种质芽期耐盐性研究

挑选大小一致、无虫眼的山蚂蝗属种子，均匀地放入铺有两层滤纸的培养皿中，每皿30粒，分别加入10 mL浓度为0、3、6、9 g·L-1的NaCl溶液进行盐胁迫处理，以无离子水培养作对照，设3次重复。将培养皿置于光照培养箱中，温度为25 ℃恒温，每天光照12 h，光照强度2 500 lx。第8天统计发芽数，以芽长超过种子长度的1/2，且根长等于种子长度为发芽标准。

2.2 山蚂蝗属种质苗期耐盐性研究

试验采用沙培盆栽。河砂在使用前先用清水冲洗，再用高锰酸钾消毒，清洗，烘干备用。在花盆中撒入足量种子，待苗长至20 cm时进行间苗，每盆留5株生长一致的健康苗。定时定量往花盆中浇入浓度为0、3、6、9 g·L-1的NaCl溶液，3次重复。

2.3 数据处理

2.3.1山蚂蝗芽期盐胁迫测定指标

采用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行数据统计分析，并根据公式用单因素方差分析法分析同一盐浓度下不同材料间及同一材料不同浓度间相对发芽率、相对发芽势、发芽指数、胚芽长、胚根长以及苗重的差异，并计算同一盐浓度下不同材料间各指标变异系数。

发芽率(%)=(发芽总数/参试种子总数)×100%；

发芽势(%)=(第3天发芽种子粒数/参试种子总粒数)×100%；

发芽指数=∑(DG/DT)，式中，DG为逐日发芽数，DT为相应DG的发芽天数；

耐盐浓度(%)=发芽率达对照发芽率75%时相对应的盐浓度；

盐极限浓度(%)=发芽率达对照发芽率10%时相对应的盐浓度；

耐盐半致死浓度(%)=发芽率达对照发芽率50%时相对应的盐浓度；

某一指标性状相对值=盐胁迫下性状测定值/对照性状测定值。

2.3.2山蚂蝗苗期胁迫测定指标

盐胁迫15 d时测定生理指标，其中叶绿素含量用乙醇提取比色法测定，采用电导法测定质膜相对透性，脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定；22 d时测定生物学指标，测量5株幼苗自然高度。

2.3.3耐盐性综合评价

利用模糊数学中求隶属函数的方法进行各指标抗盐性综合评价，其公式为

A：U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

B：1-(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1，2，3，…，n；式中，j表示第j个指标值，Xj表示性状指标的测定值，Xmin、Xmax分别为6个供试材料某一性状指标的最小值和最大值，如果抗性指标测定值与抗性呈正相关，用A式，反之则用B式。

先求出各个抗盐指标在不同盐浓度下的隶属函数值，再将每一指标在不同盐浓度下的隶属函数值累加求平均值，最后再将各品种不同抗盐指标的隶属函数值累加求平均值，其平均值即为综合评价值D，D值越大则说明其抗盐性越强。

3 结果与分析

3.1 盐胁迫对山蚂蝗种质芽期生长的影响

3.1.1盐胁迫对山蚂蝗种质相对发芽率和相对发芽势的影响

由图1、图2可看出，随着盐浓度的升高，6份山蚂蝗种质的相对发芽率、相对发芽势均呈明显下降趋势(p<0.05)，且与对照相比，盐胁迫后其相对发芽率、相对发芽势分别降低2.14%～100%、13.465%～100%，并且盐胁迫浓度越高其降低幅度越大，但各材料对盐胁迫的表现并不一致。在3 g·L-1NaCl浓度下，假地豆、异叶山蚂蝗、糙伏山蚂蝗、卵叶山蚂蝗的相对发芽率均高于100%，异叶山蚂蝗和卵叶山蚂蝗的相对发芽势高于100%，说明低盐浓度，对部分山蚂蝗种质的发芽有促进作用，且假地豆、异叶山蚂蝗、显脉山蚂蝗、卵叶山蚂蝗的相对发芽率均显著高于长波叶山蚂蝗。在6 g·L-1NaCl浓度下，假地豆和异叶山蚂蝗表现较优，相对发芽率极显著高于长波叶山蚂蝗和卵叶山蚂蝗，相对发芽势极显著高于显脉山蚂蝗和长波叶山蚂蝗；在9 g·L-1NaCl浓度下，假地豆的相对发芽率最高，达72.50%，极显著高于异叶山蚂蝗、糙伏山蚂蝗、卵叶山蚂蝗及长波叶山蚂蝗；异叶山蚂蝗的相对发芽势最高(30.56%)，极显著高于显脉山蚂蝗及长波叶山蚂蝗；当盐浓度上升到12 g·L-1时，长波叶山蚂蝗和卵叶山蚂蝗未发芽，仅假地豆、异叶山蚂蝗、显脉山蚂蝗、糙伏山蚂蝗有少许发芽，其中，假地豆的相对发芽率和相对发芽势均最高，分别为29.44%、6.67%。

3.1.2盐胁迫对山蚂蝗种子发芽指数的影响

由表4可以看出，随着盐浓度的升高，6份山蚂蝗属种质材料的发芽指数均呈下降趋势，并且各品种间表现出显著差异。根据方差分析表明，所有盐处理对6份种质材料的发芽指数均有极显著影响(p<0.01)；同一浓度下各材料间发芽指数变异系数随盐浓度增加呈逐渐增加趋势，对照的变异系数为0.34，而当盐浓度为12 g·L-1时，变异系数达1.03，说明高盐浓度下材料间的发芽指数差异较大，表现出对高盐适应性的不一致。在不同NaCl浓度下，假地豆的发芽指数均表现优于其他5份种质，说明假地豆的种子活力较强，在山蚂蝗属中表现出较强的耐盐性。

3.1.3盐胁迫对山蚂蝗种质苗重的影响

对不同浓度NaCl胁迫下6份山蚂蝗属种质进行10株幼苗苗重测定(图4)表明，随着盐浓度的上升，假地豆、异叶山蚂蝗、卵叶山蚂蝗的苗重呈下降趋势，显脉山蚂蝗、长波叶山蚂蝗和糙伏山蚂蟥却呈不规则变化，不同种间在同一浓度下表现出显著差异(p<0.05)。对同一浓度下不同品种的苗重进行方差分析发现，在不同盐浓度下，显脉山蚂蝗均与其他种之间存在显著差异(p<0.05)；随着盐胁迫浓度的升高，各种间的降幅也随之增加。

3.1.4盐胁迫对山蚂蝗胚根长及胚芽长的影响

由图5可以看出，随着盐浓度的上升，6份山蚂蝗属种质材料的胚根长均呈现明显的下降趋势。经方差分析可知，在0～9 g·L-1的盐浓度范围内，不同品种间的胚根长呈不同程度的显著差异，当盐浓度上升到12 g·L-1时，假地豆的胚根长最长，与其他品种存在显著差异(p<0.05)，而其余5个品种间没有差异；当盐浓度上升到15 g·L-1时，各品种间均不存在差异，因此对于筛选耐盐性品种的意义不大。

由图6可以看出，随着盐浓度的升高，除了糙伏山蚂蟥外，其他5个种质材料的胚芽长均呈下降趋势。在0～3 g·L-1的盐浓度范围内，6份山蚂蝗种质材料的胚芽长的下降速率均比较低，表明这6份种质材料对低盐浓度具有一定的适应性。经方差分析可知，在0～9 g·L-1的盐浓度范围内不同品种间呈显著差异(p<0.05)，当盐浓度上升至12 g·L-1时，显脉山蚂蝗与其他品种具有显著差异。

3.1.5不同浓度盐处理下山蚂蝗属种质的耐盐浓度、盐极限浓度以及耐盐半致死浓度

由表2可以看出，假地豆的耐盐浓度最高，说明假地豆对盐浓度具有很强的适应性，并且其盐极限浓度和耐盐半致死浓度均最大，因此可以初步判定假地豆的耐盐性最强；异叶山蚂蝗和显脉山蚂蝗的3个浓度均一样，可以初步表明两者的耐盐性相差不大；长波叶山蚂蝗、糙伏山蚂蟥和卵叶山蚂蝗三者耐盐浓度一样，但相比来说糙伏山蚂蟥对高盐浓度的适应性更强。

表2 山蚂蝗属种质的耐盐浓度、盐极限浓度以及耐盐半致死浓度Table 2 Comparasion of the salt-tolerant concentration,the limiting salt concentration and the half-lethal concentration of salt tolerance in Desmodium germplasms

3.1.6山蚂蝗萌芽期耐盐性综合评价

一般而言，采用隶属函数法对植物抗逆性进行评价时，某材料的综合评价值越高，其抗性就越强，反之就越弱。通过隶属函数法对6份山蚂蝗属种质材料进行耐盐性综合评价(见表3)，耐盐性强弱顺序为：假地豆>显脉山蚂蝗>糙伏山蚂蝗>异叶山蚂蝗>卵叶山蚂蝗>长波叶山蚂蝗。

表3 不同NaCl浓度下山蚂蝗属种质萌芽期耐盐综合评价Table 3 Comprehensive evaluation on salt tolerance of Desmodium germplasms at germination stage with different NaCl concentrations

3.2 盐胁迫对山蚂蝗苗期生长发育的影响

3.2.1盐胁迫对山蚂蝗株高的影响

盐浓度的升高会阻碍植株的生长。试验结果表明，随着盐浓度的升高，山蚂蝗幼苗的生长明显受到抑制，且不同的材料之间对盐胁迫的耐受能力差异较大(表4)。盐胁迫处理后，除异叶山蚂蝗的株高呈先增高后下降趋势外，其他材料均表现为下降趋势，说明异叶山蚂蝗在低盐浓度有较强的耐受性。在同一浓度下对不同材料进行方差分析，结果表明，不同盐浓度下各材料间均表现出明显差异(p<0.05)。

表4 不同盐浓度下植株高度的变化Table 4 Variation of plant height under different salt concentrations

3.2.2盐胁迫对山蚂蝗叶绿素含量的影响

耐盐性高的植物具有较高的叶绿素，可以维持植物自身较高的光合速率，从而保持自身的正常生长。从表5可以看出，随着盐浓度的升高，山蚂蝗幼苗表现出明显的下降趋势，但不同种的山蚂蝗在盐胁迫下表现出不同程度的差异。假地豆、显脉山蚂蝗、长波叶山蚂蝗和卵叶山蚂蝗在3 g·L-1时变幅最大，而异叶山蚂蝗和糙伏山蚂蟥在6 g·L-1时变幅最大。

表5 不同盐浓度下叶片叶绿素质量分数的变化Table 5 Changes of chlorophyll content in leaves under different salt concentrations

3.2.3盐胁迫对山蚂蝗质膜透性的影响

细胞质膜透性小，说明在盐胁迫下的外渗物较少，耐盐性较强。并且耐盐性强的材料细胞膜受害较轻，质膜透性的变化幅度也较小。由表6可知，随着盐浓度的升高，山蚂蝗叶片质膜透性显著升高，不同种间也表现出显著差异(p<0.05)。当盐浓度上升至9 g·L-1时，6份材料的叶片质膜透性均达到最大。与对照相比糙伏山蚂蟥变幅最大，为144.53%，长波叶山蚂蝗变幅最小，为64.42%。

表6 不同盐浓度下叶片质膜透性的变化Table 6 Changes of membrane permeability in leaves under different salt concentrations

3.2.4盐胁迫对Pro含量的影响

在盐胁迫下，Pro含量会迅速上升。试验结果(表7)表明，随着盐浓度的升高，植株体内的Pro含量呈上升趋势，并且在盐浓度达到9 g·L-1时，Pro含量达到最大。在0～3 g·L-1的盐浓度内，山蚂蝗各种间表现出显著差异(p<0.05)；当盐浓度上升至6 g·L-1时，各种间不再表现出差异(p>0.05)，并且在9 g·L-1时，山蚂蝗各种间的变幅最大。

表7 不同浓度下叶片Pro含量的变化Table 7 Changes of proline (Pro) content in leaves under different salt concentrations

3.2.5盐胁迫对MDA含量的影响

一般认为MDA的含量越高，植物体的抗性就会越弱。由表8可知，随着盐浓度的升高，植物体内的MDA含量也随之增大，说明植物的抗性逐渐变弱，即盐胁迫影响越大。在同一浓度对不同种进行方差分析可得，不同种间存在显著差异(p<0.05)。当盐浓度上升为9 g·L-1时，假地豆变幅最大，为212.99%，异叶山蚂蝗的变幅最小，为40.42%。

表8 不同浓度下叶片MDA含量的变化Table 8 Changes of malondialdehyde (MDA) in leaves under different salt concentrations

3.2.6山蚂蝗苗期耐盐性综合评价

通过隶属函数法对6份山蚂蝗属种质材料进行耐盐性综合评价(见表9)，耐盐性强弱顺序为：假地豆>显脉山蚂蝗>糙伏山蚂蝗>卵叶山蚂蝗>异叶山蚂蝗>长波叶山蚂蝗。

表9 山蚂蝗苗期隶属函数值及综合评价Table 9 Comparasion of subordinative function value and comprehensive evaluation in Desmodium germplasms

4 讨 论

研究表明，种质萌芽期和苗期对盐胁迫的反应最为敏感[11-12]。而植株的耐盐程度决定了植物种子的萌发状态及苗期的生长发育，因此耐盐性评价多从种子萌发状况(发芽率、发芽势、发芽指数)和苗期生长状态(株高、叶绿素含量。质膜透性、Pro含量等)进行综合考虑，但会因植物种类的不同导致其对盐胁迫的响应存在一定差异。盐胁迫对种子的影响是多方面的，不仅表现在形态方面，同时也会表现在具体的生理生化过程中。同时，由于多指标对耐盐的反应程度不一致，因此一般采用多个指标结合隶属函数的方法[13-14]或打分法[15]等对材料耐盐性进行研究。本试验通过对山蚂蝗种子萌芽期形态指标的测定和苗期生理指标的测定，运用隶属函数，共同探讨山蚂蝗种质的耐盐性。

本研究表明，随着盐胁迫浓度的上升，山蚂蝗种子的相对发芽率、相对发芽势、发芽指数等指标和幼苗期的株高、叶绿素含量均表现出下降趋势，说明盐胁迫会降低种子生理活力，抑制种子正常生长发育。

盐胁迫下植物体内产生大量活性氧自由基，对细胞膜脂造成直接损伤，电解质外渗率能反映膜系统的完整性，电解质外渗越多，细胞膜的损伤程度越大，MDA是膜脂过氧化的主要产物，可衡量膜损伤程度的大小[16]。本研究结果表明，山蚂蝗幼苗期随胁迫时间延长和胁迫程度加剧，质膜透性和MDA含量逐渐增加，与冯宇等[17]对豇豆耐盐性的研究结果相似。游离氨基酸有助于保护细胞膜的完整性，清除活性氧以及稳定酶蛋白质结构[18]。Pro作为渗透调节剂在逆境时协助植物体抵御渗透胁迫带来的伤害，NaCl的添加促进Pro积累，Pro保护细胞膜结构的完整性，从而提高了植物的抗逆性。因此，在本研究中，随着盐浓度的增加，Pro含量也逐渐增加。

通过多重比较可得，同一浓度下6份山蚂蝗种质间表现出明显差异，说明不同种间对盐胁迫的耐性不同。通过隶属函数值的方法对参试的6份山蚂蝗种质材料萌芽期和苗期分别进行分析，两次综合评价都得出假地豆的耐盐性最强，说明假地豆萌芽期和苗期的耐盐性都较好，可作为耐盐品种选育；其余5份山蚂蝗在萌芽期和苗期分别表现出不同的耐盐性。异叶山蚂蝗在萌芽期的耐盐性较卵叶山蚂蝗强，但在苗期，其耐盐性弱于卵叶山蚂蝗。长波叶山蚂蝗在萌芽期及苗期的耐盐性评价都表现最弱，因此在培育长波叶山蚂蝗时应当注意盐浓度的变化，以保证种子的正常萌芽和苗期的正常发育。

5 结 论

在山蚂蝗芽期阶段，随着盐胁迫浓度的增加，6份山蚂蝗属种质间的相对发芽率、相对发芽势、发芽指数、苗重、胚根长以及胚芽长均表现出不同程度的差异；6份山蚂蝗种质的耐盐浓度为3～9 g·L-1，盐极限浓度为9～12 g·L-1，耐盐半致死浓度为6～9 g·L-1，其中假地豆的耐盐浓度、盐极限浓度和耐盐半致死浓度均最大，分别为9、12、9 g·L-1；通过隶属函数综合评价参试材料的耐盐性，认为假地豆和显脉山蚂蝗的耐盐性较强。

在山蚂蝗苗期阶段，随着盐浓度的增加，6份山蚂蝗属种质的质膜透性、Pro含量、MDA含量均表现出上升趋势，叶绿素含量呈下降趋势，且种质间均存在不同程度的差异。通过隶属函数法对6份山蚂蝗属种质材料进行耐盐性综合评价，耐盐性强弱顺序为：假地豆>显脉山蚂蝗>糙伏山蚂蝗>卵叶山蚂蝗>异叶山蚂蝗>长波叶山蚂蝗。