香附子根茎提取物对植物病原真菌的抑菌活性

王灿灿，林海鸥，刘书宇，唐文伟，曾东强

（广西大学农学院植保系 南宁市 530005）

香附子Cyperus rotundusL.，为莎草科Cypera⁃ceae 莎草属Cyperus植物，又名三菱草、莎草、回头青等，原产于印度，国内分布于陕西、甘肃、山西、河南、河北、山东、江苏、浙江、江西、安徽、云南、贵州、四川、福建、广东、广西和台湾等省区[1]。

香附子是玉米、甘蔗、蔬菜等农作物田的恶性杂草，严重危害农作物的生长，但其根茎是一种常见的中草药，在民间常用于治疗各种炎症性疾病，有“妇科圣药”、“气中之血药”之称。香附子挥发油现已在我国实现商品化生产，主要采用β-环糊精对其进行包合，并制成相应的制剂，如胶囊剂等，用于治疗各种临床疾病[2]。前人对香附子化学成分已进行了系统的研究，基本明确其主要的化学成分类型有倍半萜、单萜、三萜、黄酮、糖苷、甾醇、生物碱及其他类化合物。目前，对于香附子根茎化学成分活性的研究主要集中在人体病原细菌及真菌，初步的研究结果表明，香附子中具有抑制植物病原真菌的活性成分。

本研究拟采用菌丝生长速率法，测定香附子根茎甲醇粗提物及其萃取物对常见植物病原真菌的抑菌活性，以期为进一步提取分离香附子根茎中抑菌活性成分、为寻找新型杀菌剂的先导化合物提供依据和线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 香附子根茎

采自广西大学扶绥农科基地甘蔗田。选取生长状况良好的香附子根茎。

1.1.2 化学试剂

甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等，分析纯（天津富宇试剂公司和成都市科龙化工试剂厂生产）。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（PDA），广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.4 植物病原真菌

火龙果溃疡病菌Neoscytalidium dimidiatum（Penz.） Crous & Slippers、禾谷镰刀菌Fusarium graminearumSchwabe、苦瓜枯萎病菌Fusarium oxysporunf.sp.Momordicae、马铃薯立枯丝核菌Rhizoctonia solaniKühn、姜白绢病菌Sclerotium rolf⁃sii、甘蔗梢腐病菌Fusarium moniliformeSheldon、香蕉煤纹病菌Helminthosporium torulosum（Syd.）Ashby.、 甘 蔗 凤 梨 病 菌Ceratocystis paradoxaMoreau、 甘 蓝 黑 斑 病 菌Alternaria brassicicola（Schw）Wiltshire，以上植物病原真菌均来源于广西大学农学院植物病理研究室，菌种保存于4℃冰箱，试验前重新接菌活化以备用。

1.2 试验方法

1.2.1 香附子根茎提取物制备

1.2.1.1 甲醇粗提物制备

将采集的香附子根茎用清水清洗干净，在通风良好的地方晾干，放入恒温鼓风干燥箱于50℃烘干后进行粉碎处理，过100 目筛，得到5 kg 粉末。将粉碎后的样品置于3 L的锥形瓶中，用甲醇冷浸超声（2 h/次）提取3 次（样品：甲醇体积比1∶5）后过滤，将收集得到的滤液于55℃减压浓缩至近干，得到1 200 g甲醇粗提物浸膏。

1.2.1.2 萃取物制备

将香附子根茎甲醇粗提物浸膏加适量的去离子水悬浮，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，合并萃取液，浓缩至膏状，分别得到香附子根茎的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相浓缩物。

1.2.2 香附子根茎提取物抑菌活性测定

采用菌丝生长速率法测定香附子根茎甲醇粗提物和各萃取物对9种植物病原真菌的抑制作用[9]。分别称取定量（甲醇粗提物1 g，萃取物0.5 g）的待测提取物，加入一定量的甲醇（甲醇含量不超过2%），充分溶解，加入无菌水配成目标浓度的母液（甲醇粗提物为1 000 mg/mL，萃取物为500 mg/mL），取 1 mL 与 99 mL 的 PDA 培养基融合，充分混匀，倒入直径7.5 cm 的培养皿中，得到供试含药培养基，置于超净工作台中冷却，用菌种打孔器从活化好的菌种培养基上打出直径6 mm的菌饼，将菌饼倒放于培养基的中央，置于28℃的恒温培养箱中培养，每个处理重复3次，以含有等量甲醇的处理为对照组。待对照组菌落直径达到5 cm 以上时，采用十字交叉法测量菌落直径，并按下述公式计算其抑菌率。

抑菌率（%）=（D1-D2）/(D1-6)×100

式中D1表示对照组菌落直径，D2表示处理组菌落直径（单位：cm）。

1.2.3 香附子根茎萃取物对病原真菌菌丝生长的毒力测定

选取各萃取物对供试植物病原真菌菌丝生长抑制率在70%以上的病原真菌采用菌丝生长速率法进行进行毒力测定。将待测萃取物用一定量的甲醇溶解，用无菌水稀释成浓度为500 mg/mL 的母液，然后用倍半稀释法制成一系列浓度梯度的母液。在超净工作台中，取1 mL 系列浓度梯度的母液与99 mL 已融化的PDA 培养基混合，分别配置成浓度为5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL 和0.312 5 mg/mL 等一系列的含药培养基。其他操作步骤同1.2.2。计算香附子根茎各萃取物对病原真菌的EC50。

1.2.4 数据分析

试验数据利用Excel 2019 和SPSS 软件进行统计分析。方差分析采用单因素分析（ANOVA）和Duncan’s新复极差法。

2 结果与分析

2.1 香附子根茎提取物对病原真菌抑菌活性的测定

香附子根茎甲醇粗提物对9种供试植物病原真菌的抑菌活性结果（见表1）表明：其对供试植物病原真菌均具有一定程度的菌丝生长抑制活性。在10 mg/mL浓度下对姜白绢病菌的抑制效果最为显著，抑制率达到了100%；对禾谷镰刀菌和甘蔗凤梨病菌的抑制效果次之，抑制率分别为81.84%、81.21%；马铃薯立枯丝核菌、甘蔗梢腐病菌和香蕉煤纹病菌的抑制作用最差，抑制率在43.79%~46.07%之间。

在5 mg/mL浓度下，石油醚萃取物对9供试植物病原真菌的抑制率均在50.00%以上，其中对禾谷镰刀菌、姜白绢病菌和甘蔗凤梨病菌的抑制效果最为显著，抑制率在85%以上，对香蕉煤纹病菌的抑制效果最差，抑制率仅有50.00%；乙酸乙酯萃取物对禾谷镰刀菌、苦瓜枯萎病菌、姜白绢病菌、甘蔗凤梨病菌和甘蓝黑斑病菌的抑制率均达到90%以上，对马铃薯立枯丝核菌和甘蔗梢腐病菌的抑制作用最差，抑制率在60%以下，正丁醇萃取物仅对火龙果溃疡病菌、马铃薯立枯丝核菌、甘蔗梢腐病菌等3种病原菌具有抑菌活性，且抑制率仅在50%左右，水萃取物则对供试植物病原真菌均无抑制作用。生物活性测定结果说明，香附子根茎中具有抑菌活性成分可能主要分布于石油醚和乙酸乙酯萃取物中。

表1 香附子根茎提取物对9种植物病原真菌菌丝生长抑制活性

2.2 香附子根茎萃取物对植物病原菌菌丝生长的毒力

2.2.1 石油醚萃取物对植物病原真菌丝生长的毒力

香附子根茎石油醚萃取物对供试植物病原真菌菌丝生长的毒力测定，抑制效果见表2 和图1。结果表明，石油醚萃取物对所测定5种菌的EC50均较低，其中火龙果溃疡病菌和姜白绢病菌的抑制作用的EC50最低，分别为0.36 mg/mL和0.37 mg/mL，对禾谷镰刀菌菌丝生长抑制效果次之，EC50分别为0.50 mg/mL；但与对照药剂的EC50相比，仍有较大的差距。

表2 香附子石油醚萃取物对5种植物病原真菌的EC50值

2.2.2 乙酸乙酯萃取物对植物病原真菌丝生长的毒力测定

香附子根茎乙酸乙酯萃取物对供试病原真菌菌丝生长的毒力测定结果表明（表3、图2），乙酸乙酯萃取物对所测定6种病原真菌中，对火龙果溃疡病菌、姜白绢病菌和甘蔗凤梨病菌菌丝生长的EC50较低，分别为 0.42 mg/mL、0.52 mg/mL 和0.35 mg/mL，对甘蓝黑斑病菌的抑制效果次之，其EC50为0.9 mg/mL，对禾谷镰刀菌和苦瓜枯萎病菌菌丝生长的EC50均为1.16 mg/mL；但与对照药剂的EC50相比，仍存在较大的差距，香附子根茎乙酸乙酯萃取物的EC50在0.35～1.16 mg/mL，而对照药剂的EC50在0.03～1.90 μg/mL。

图1 香附子石油醚萃取物在不同浓度下对5种病原真菌菌丝生长的抑制效果

图2 香附子乙酸乙酯萃取物在不同浓度下对6种病原真菌菌丝生长的抑制效果

表3 香附子乙酸乙酯萃取物对6种植物病原真菌的EC50值

3 结论与讨论

研究结果表明，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对供试植物病原真菌的抑制均较好。香附子根茎的活性成分集中分布在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

本研究中石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对镰刀菌属的3 种病原真菌（F.graminearum、F.oxysporum、F.moniliforme）的抑菌结果表明，2 种萃取物对禾谷镰刀菌（F.graminearum）和苦瓜枯萎病菌（F.oxysporum）抑制效果较好，对甘蔗梢腐病菌（F.moniliforme）的抑制效果次之，其中对禾谷镰刀菌的抑制率均在80%以上，对苦瓜枯萎病菌的抑制率均在69%以上。Zahide Özdemir等人的研究表明，香附子根茎乙酸乙酯提取物对Botrytis cinerea和Fusarium udum菌丝生长和孢子萌发有抑制作用[3-4]。且香附子根茎石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对链格孢菌属的甘蓝黑斑病菌的抑制率分别为为78.28%和100%。Singh A 等人的研究表明香附子根茎乙酸乙酯提取物对链格孢菌属 （A.alternata、A.brassisicola、A.solani、A.chearanthi和A.brassisicola）的抑制效果较好[5]。同时，本研究结果显示，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对姜白绢病菌（S.rolfsii）、火龙果溃疡菌（N.dimidiatum）和甘蔗凤梨病菌（N.dimidiatum）均有较好的抑制效果，其抑制率均在75%以上。

目前香附子中已鉴定结构的有1,8-cineole、amentoflavone、 ginkgetin、 bilobetin 和 sciadopitysin、physcion 等多种类型的化合物[6-9]，通过文献查阅发现，已在其他植物中分离并有相关活性的研究。研究表明，蓝桉中的单萜类化合物1,8-cineole 对真菌黄曲霉Aspergillus flavusLink和寄生曲霉Aspergillus parasiticusSpeare 的均抑制作用[10]。红豆杉和银杏中分离的双黄酮类化合物amentoflavone、ginkgetin、bilobetin 和 sciadopitysin 对交替交链格孢Alternaria alternata、镰刀菌Fusarium culmorum、尖孢枝孢菌Cladosporium oxysporum均有一定的抑制作用；sciadopitysin 对镰刀菌的抑制效果较好，其 ED50为 9 µM；bilobetin 对 3 种供试植物病原真菌有显著的抗真菌活性，其ED50分别为14、11 和17µM，在100 μM 浓度下完全抑制了尖孢霉和镰刀菌萌发管的生长[11]。此外，人工合成的蒽醌类化合物physcion 可显著降低了番茄灰霉病的发病率，以9 g a.i./ha 的剂量施用physicon，可使发病率降低63.44%～69.79%，与杀菌剂乙胺嘧啶酯的抑制效果相当[12]。本研究结果显示，香附子根茎石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物对多种植物病原真菌有很好的抑菌效果，值得进一步的研究。