自制实时定量PCR试剂在基因扩增中的效果评价

＊姬丽娟 李倩 李汉超 郝志明

（西安交通大学 陕西 710000）

引言

实时定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR），PCR聚合酶联反应是体外选择性扩增特定基因片段技术，被广泛应用临床基因诊断、食品安全、环境污染检测，该项技术能够准确的获取基因片段，且特异性、灵敏度高，是目前检测核酸拷贝数的可靠方法之一。

1.Taq DNA聚合酶的制备

(1)Taq-DNA聚合酶的表达

取pTaq质粒lμL与感受态大肠杆菌E coli DH5a菌株进行混合，冰浴30min，42℃水浴90s，然后冰浴5min，进行质粒的热休克。加入500μL不含氨苄青霉索（Amp）的LB液体培养基，37℃振荡培养2h。取100μL培养液均匀涂布在含有100μg/mL氨苄青霉（Amp）的LB固体培养基，置于37℃培养箱中，培养24h，挑选阳性重组克隆。转接于Amp浓度为100μg/mL的5mL LB液体培养基，37℃、180r／min培养2h（OD600=0.4）后，加入100μL IPTG（1mol/L），37℃180r/min振荡培养6h，诱导Taq-DNA聚合酶基因的表达。

(2)Taq DNA聚合酶的提取和纯化

3500rpm离心10分钟收集菌体，按10:1体积加入重悬液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L DTT，10%甘油）重悬沉淀，具体纯化过程参考文献刘钦松重组Taq DNA聚合酶的表达和纯化鉴定。

(3)重组Taq DNA聚合酶的活性测定

PCR反应体系总体积为20μL，反应组成为：商品化的10×PCR buffer 2μL，引物F（20μM）0.2μL，引物R（20μM）0.2μL，模板pAAV-LacZ 0.5μL，MgCl2（20mmol/L）2μL，d NTP（2.5mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（0.1μL，0.5μL，1μL，2μL），灭菌ddH2O补足20μL。即用不同浓度纯化的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增实验，以市售商品化的Taq DNA聚合酶（天根）1U为对照。通过比较扩增产物电泳条带的亮度估算纯化的酶活性及用量，用于后续实验的PCR扩增。

根据引物CMV（正向引物F：5'-GCGTGGATAGCGGTTTGACT-3'反向引物R：5'-CAATGGGGCGGAGTTGTT-3'）确定扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，30个循环。循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳仪进行检测产物质量。

2.实时定量PCR mix的配置及条件优化

(1)配置实时定量PCR mix

参照EvaGreen染料说明书以及文献配方，自制的10×PCR buffer配置方法如下：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5% Triton X-100。

在总体积为20μL的PCR反应体系中，反应组成如下：自制的10×PCR buffer 2μL，引物F（20μM）0.2μL，引物R（20μM）0.2μL，pAAV-LacZ 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL（根据1.3实验结果所得），EvaGreen1μL，灭菌ddH2O补足20μL。以商品化10×real-time PCR mix做对照，反应体积及反应组成同上。引物及扩增反应程序同1.3。循环结束后4℃保存。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)自制实时定量PCR试剂的优化

在现有的反应体系中，我们尝试分别加入二甲基亚砜（DMSO）、甘油、甲酰胺、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）等对PCR反应体系有增强作用的试剂，观察对real-time PCR结果有无影响。具体用量：DMSO 5%；甘油10%；甲酰胺5%；海藻糖0.1mol/L；BSA：50mg/L；余条件同2.1。并将起始浓度为1.2×1012copies/mL的AAV-LacZ质粒模版进行10倍稀释，连续7个梯度，观察自制试剂与商品化试剂的差异。

3.自制实时定量PCR mix的稳定性验证

将配置的自制实时定量PCR mix 1mL在-80℃下反复冻融，每次冻融后取样100μL于4℃保存，用于后续PCR扩增。待冻融7次之后，以pAAV-LacZ为模版进行PCR扩增反应，收集荧光信号，观察Ct值变化。

(1)数据分析

数据采集，PCR反应效率，标准曲线拟合等均应用（数据分析软件PCR分析仪电泳仪）。

(2)实验结果

原核表达纯化的Taq DNA聚合酶纯度较高，与商品化的Taq DNA聚合酶活性接近。

4.自制real-time PCR mix的条件优化

（1）自制的PCR mix与市售的mix对比，结果显示：自制的实时定量PCR试剂与商品化试剂扩增曲线接近，琼脂糖凝胶电泳结果显示qPCR扩增条带单一清晰。

（2）PCR反应增强剂对qPCR影响。在现有的PCR mix中分别加入DMSO、甘油、甲酰胺、海藻糖、BSA等文献中报道对PCR反应体系有增强作用试剂，加入甘油和BSA的PCR反应体系qPCR的Ct值与不加反应增强剂的接近，加DMSO，海藻糖的PCR体系Ct值均大于不加任何增强剂的Ct值，而加入甲酰胺后无Ct值。因此，下一步优化甘油和BSA的使用浓度。

甘油5%、10%，BSA 50mg/L、100mg/L两个梯度，两种单独或者组合搭配，行qPCR观察扩增效率。可见使用5%甘油+100mg/L BSA时，qPCR的Ct值最小。因此，最终选择5%丙三醇+100mg/L BSA。

（3）优化后qPCR mix与市售商品化qPCR mix的扩增效率比较。优化后real-time PCR mix组成：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5%Triton X-100，dNTP，Taq DNA聚合酶，EvaGreen，5%丙三醇+100mg/L BSA。

在相同反应参数、反应体系下，倍比稀释模板（1012，1011，1010，109，108，107，106，105），观察自制qPCR扩增曲线及Ct值与市售罗氏和Gene Star qPCR mix差异。自制qPCR的扩增曲线良好，Ct值随模版浓度的降低逐渐增大，与罗氏和Gene Star qPCR mix无明显差异。

（4）自制10×qPCR mix的稳定性检测。将自制10×qPCR mix反复冻融后行qPCR，经反复冻融后，qPCR扩增曲线及Ct值均无明显变化。

5.结论与讨论

据目前所了解市售商品化real-time PCR mix大多采用SYBR Green I作为其荧光染料，SYBR Green I是利用插入双链DNA小沟中发光的特性监测扩增产物增加，使用简便易行、成本较低，但特异性相对较差，同时对PCR反应有一定的抑制作用，染料浓度以及染料与反应体系组成需要繁琐严格的优化。而EvaGreen是常用于高分辨率溶解曲线分析的饱和DNA双链荧光染料，荧光信号强，不抑制PCR反应。因此，本实验直接采用EvaGreen作为荧光染料进行后续实验。

各种PCR反应增强剂作用机理不同，DMSO主要用于高GC含量的模板扩增，可能的机理是改善CG含量高的DNA变形情况，降低其二级结构，使得聚合酶在二级结构处延伸，一般超过体积的10%会影响其保真性；甘油：保护Taq酶，增加酶的稳定性，以提高产量；甲酰胺：促进引物-模板退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度；海藻糖亦主要用于高GC含量模板的扩增；BSA是某些酶的稳定剂，还能防止酶蛋白在玻璃器皿表面的附着。而在本实验中，甲酰胺，海藻糖，DMSO均不同程度的影响了qPCR的反应效率，可能与其用量及试剂本身的纯度有关，需要进一步的实验验证。

本实验中，原核表达纯化Taq DNA聚合酶具有较高的纯度，0.1μL的自制酶活性与1U市售Taq DNA聚合酶相当。以此酶自制10×qPCR mix：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5% Triton X-100，dNTP，Taq DNA聚合酶，EvaGreen，5%丙三醇+100mg/L BSA。该试剂扩增效率与市售商品化qPCR mix无差异，易保存，稳定性良好且价格便宜，可广泛应用于核酸定量检测。