扬州茱萸湾风景区森林土壤细菌多样性研究

万 欣，王 磊*，李文斌，江 浩

(1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153；2.江苏扬州城市森林生态系统国家定位观测研究站，江苏 扬州 225000；3.扬州市茱萸湾风景区管理处，江苏 扬州 225000 )

随着人们对城市森林生态环境的关注,对城市森林的生物多样性研究工作日益重视。土壤中的微生物以其丰富的生物多样性使它们成为生态系统中最活跃和具有决定性影响的组分之一[1-2]。已有研究表明，森林土壤微生物群落作为分解者、共生体或病原体，在调节生物地球化学循环方面起到关键作用[3-4]。土壤细菌的群落结构特征是表征森林土壤环境质量变化的最敏感、最有潜力的指标，其种群、数量、分布及多样性等群落结构特征可直接或间接地影响森林土壤的基本理化性质，进而影响森林树木的生长发育[5-8]。因此，研究土壤细菌的群落结构和物种多样性在评价各种因素(包括自然因素和人为因素)干扰导致的森林土壤质量变化方面起着重要的指示作用。

本研究选取扬州市茱萸湾风景区内6种不同植被类型的城市森林作为研究对象，对不同植被类型下土壤细菌群落结构及多样性指数进行比较研究，以期为该地区城市森林生态系统服务功能的保护、合理利用土壤、营造最佳生态效益的林分、防止地力衰退提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究样地概况

本研究地点设在扬州市广陵区茱萸湾风景区内，是江苏扬州市城市生态系统国家定位观测研究站的主站点。该区域属于亚热带季风性湿润气候向温带季风气候的过渡区，平均海拔2 m，年均气温15.8 ℃，年均降水量864 mm。该区域的植被为地带性次生林植被，林分生长良好，在长江下游平原水网地区具有典型性和代表性。经实地调查取点，确定6个不同植被种类的城市森林样地作为本研究的研究样点，每个样点各设置样地1个。样地的具体位置和概况见表1。

表1 样地概况

1.2 土壤样品采集和处理

在每个样地内的四角与中心选取5个采样点，将表面的腐殖质层移除后，用土钻采集土壤深度0—20 cm的土层，挑出凋落物、细根和小石块等杂物后充分混合，以减少异质性带来的影响。土壤样品过2 mm尼龙筛放入自封袋密封，以备测定土壤细菌群落多样性[9]。

1.3 土壤细菌群落结构及多样性测定[10]

称取0.5 g新鲜土样，按照美国强力土壤试剂盒的说明书来提取土壤细菌DNA。设计16Sv3-v4区特定引物扩增特异区域，得到420 bp左右扩增片段。加接头，采用Hiseq 2500平台，测序得到2×300 bp的paired-end数据，通过拼接，可以得到较长序列，从而进行16 S分析[11]。

1.4 数据处理与统计分析

测序得到的原始数据(Raw Data)，存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据(Clean Data)。然后基于有效数据进行OTU聚类和物种分类分析。根据OTUs聚类结果，对每个OTU的序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时，对OTUs进行丰度、Alpha多样性计算、花瓣图分析，以得到样本内物种丰富度和均匀度信息。然后使用SPSS17.0软件采用Pearson法进行相关性分析(0.05水平)[12-13]。

2 结果与分析

2.1 土壤样品测序结果

土壤样品通过优化过滤低质量序列后得到有效序列总数为36 913条，土壤样品序列经拆分、去冗余后在97% 相似度下进行OTUs聚类共得到1 946个OTUs。为了考察指定样品间的基因数目分布情况，分析不同样品之间的基因共有和特有信息，绘制了花瓣图。由图1所见，在97%的相似水平上统计得到样地土壤细菌212个，约占OTU总数的10.89%，3号茱萸林独有的土壤细菌的OTU数目最多有83个，约占总数的4.27%。由此可见，3号山茱萸林与其他森林群落土壤细菌的OTUs分布差异较大。

注：花瓣图中每个花瓣代表一个样地的样本(分别用S1—S6表示)，不同的颜色代表不同的样地的样本，中间的core数字代表的是所有样地的样本中共有的OTU数目，花瓣上的数字代表该样地样本特有的OTU数目。图1 不同植被类型下土壤细菌OTU花瓣图

2.2 土壤细菌多样性指数

物种多样性的分析包含样品中的物种组成的丰富度和均匀度2个因素，通常用Observed Species指数、Chao指数，Shannon指数以及Simpson指数等指数来评估样本的物种多样性，指数越高，表明样本的多样性越复杂[14]。Observed Species指数和Chao1指数反映样品中群落的丰富度，即群落中物种的数量。Shannon指数和Simpson指数反映群落的多样性，受样品群落中物种丰富度和物种均匀度的影响。相同物种丰富度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性[15-16]。通过测序，6种植被类型森林土壤测序的几种多样性指数由表2所示。

表2 97%条件下各林型土样多样性指数

由表2可知，6个林型的土壤测序的Coverage指数均在0.995以上，说明该试验的测序结果能够准确反映供试土壤样品的真实情况。6个林型土壤样本中，Chao1指数和Observed Species指数以2号水杉林最高，说明该林型的土壤细菌的物种总数、菌群丰度和复杂度最高，其次是1号竹林和3号茱萸林。Shannon指数和Simpson指数也是以2号水杉林最高，说明该林型的土壤细菌群落的均匀度最高，其次是1号竹林和6号杂阔林。

2.3 土壤细菌相对丰度

在门分类水平上，相对丰度前20的物种聚类分析图如图2所示。其中，相对丰度平均值大于1%的优势菌门有11个，其相对丰度值见表3。

图2 门分类水平Top20物种相对丰度聚类图

表3 11种优势菌门在不同林分土壤中的相对丰度值 %

由表3可知，1号竹林(S1)、2号水杉林(S2)、4号杂阔林(S4)、6号杂阔林(S6)的土壤中变形菌(Proteobacteria)相对丰度最高，分别为38.15%,33.54%,44.25%,30.66%，其次是酸杆菌(Acidobacteria)、绿弯菌(Chloroflexi)、厚壁菌(Firmicutes)；3号茱萸林(S3)和5号松柏林(S5)土壤中厚壁菌相对丰度最高，分别是42.09%和41.14%，其次是变形菌、酸杆菌、绿弯菌。

为了进一步分析各林型土壤细菌群落多样性差异，本研究基于Weighted Unifrac距离来进行PCoA分析。图3为PCoA对6种林型土壤样本的土壤细菌群落多样性的分析结果，如果2个样本距离较近，则表示这2个样本的物种组成较相近。

注：横坐标表示第1主坐标，百分比则表示第一主坐标对样本差异的贡献率；纵坐标表示第2主坐标，百分比表示第2主坐标对样本差异的贡献率。图中点分别表示各个样本。S1-S6表示6种不同林型的样本。 图3 PCoA分析图

由图3可见，3号山茱萸林(S3)和1号竹林(S1)与其他林型的土壤样本距离较远，说明这2种林型的物种组成与其他4种林型的土壤细菌的物种组成有明显差异。其他4个林型的土壤样本距离较近，说明这4种林型的土壤细菌的物种组成无明显差异。

3 结论与展望

由此可见，扬州茱萸湾风景区内水杉林土壤细菌的物种总数、菌群丰度和复杂度最高，其次是竹林和茱萸林。水杉林的土壤细菌群落的均匀度最高，其次是竹林和杂阔林。山茱萸林独有的土壤细菌的OTU数目最多，与其他森林群落土壤细菌的OTUs分布差异较大；在门分类水平上，该地区相对丰度平均值大于1%的优势菌门有11个。

为深入研究城市森林土壤微生物群落在生态系统过程中的作用，希望在进一步研究中针对土壤微生物多样性、土壤理化指标和大气环境因子进行同步监测，研究大气环境-土壤-微生物之间的相关性，对于预测城市森林对未来环境条件的响应至关重要。