顺德区新生儿血红蛋白电泳及地中海贫血基因检测结果分析

魏楚洪 钟 华 文 芳 何思玲 张金凤▲

1.广东医科大学顺德妇女儿童医院 （佛山市顺德区妇幼保健院）新生儿疾病筛查中心，广东佛山 528300；

2.广东医科大学顺德妇女儿童医院 （佛山市顺德区妇幼保健院）检验科，广东佛山 528300

地中海贫血（thalassemia）是由珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成减少的一种常染色体隐性遗传性疾病，主要有α地中海贫血（α地贫）和β地中海贫血（β地贫），严重者可致死，且严重影响新生儿的健康发育[1]。地中海贫血是我国南方发病率最高的单基因遗传病[2]，据文献报道[3-4]，广东省α地贫基因携带率为8.53%，β地贫基因携带率为2.54%。为了解顺德地区新生儿地中海贫血的分布情况，本研究对我院的新生儿血红蛋白电泳及地贫基因检测的结果进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2019年1月至2020年3月我院新生儿干血斑标本9992例，男5318例，女4674例；项目经本院医学伦理委员会审批，新生儿监护人均签署知情同意书。

1.2 材料与方法

1.2.1 标本采集 新生儿出生后3～7 d，采足后跟血，从第二滴开始取血，血斑须完全渗透，直径＞8 mm，禁止重复滴血，室温平放晾干后密封存于4 ℃冰箱。

1.2.2 仪器与试剂 血红蛋白电泳：法国Sebia全自动毛细管电泳分析仪；配套试剂盒和校准品。

地贫基因检测：Abbott m2000 rt荧光定量PCR扩增仪；试剂盒和校准品由深圳亚能提供。

1.2.3 实验方法

1.2.3.1 血红蛋白电泳 取3.8 mm标本至稀释杯中，加入50 μl蒸馏水溶解，置4 ℃冰箱过夜，次日取出放室温30 min后上机检测。

1.2.3.2 初筛阳性召回 α地贫初筛阳性召回进行α地贫基因诊断，β地贫初筛阳性召回进行α地贫和β地贫基因诊断[3]；异常血红蛋白初筛阳性建议基因检测或进一步测序。

1.2.4 检测指标 血红蛋白电泳：HbA、HbA2、HbBart's、HbE、HbC、HbS以及其他异常区带（NX区）；α地贫基因检测：--SEA、-α3.7、-α4.2、α（CS、QS、WS）等；β地贫基因诊断：17种β珠蛋白基因突变。

1.2.5 初筛阳性判读标准 α地贫初筛阳性：出现HbBart's带。β地贫初筛阳性：①界值法，HbA＜9.5%。②综合分析法，HbA≥9.5%且出现微量HbA2，HbA2/HbA比值增高[5]；异常血红蛋白初筛阳性，出现HbE、HbC、HbS以及其他异常区带（NX区）。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件和Excel进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。β地贫筛查HbA截断值采用ROC描述，计算AUC，根据约登指数确定HbA截断值。

2 结果

2.1 电泳及基因分型

9992例标本初筛阳性1451例，阳性率为14.52%，召回做α地贫基因检测607例，确诊533例；进行β地贫基因检测246例，确诊171例，αβ复合型地贫共13例。α地贫基因阳性率和符合率分别为5.33%（533/9992）、87.81%（533/607），主 要 基 因 型 为 缺 失 型--SEA（51.41%）、-α3.7（27.02%）、-α4.2（10.51%）；β地贫基因阳性率和符合率分别为1.71%（171/9992）、69.51%（171/246），主要基因型为βCD41-42（43.86%），见表1。

表1 地中海贫血基因型分析

2.2 α地贫筛查结果分析

不同HbBart's含量基因确诊符合率如表2所示，仪器自动判读阳性标本实际召回检测565例，确诊533例，符合率为94.34%，当HbBart's＞1.0%时基因诊断符合率达98.12%（313/319）。

2.3 β地贫筛查结果分析

2.3.1 两种判读方法比较 临界法基因确诊符合率为62.07%，假阳性率为37.93%；综合分析法基因确诊符合率为87.50%，假阳性率为12.50%。两种判读方法结合应用可提高β地贫筛查的检出率，达69.51%。见表3。

表2 不同HbBart's水平确诊率比较

表3 HbA临界法与综合分析法对β地贫筛查的判读结果

2.3.2 β地贫筛查HbA阈值确定 根据HbA做ROC图，AUC为0.923，95%置信区间（CI）为0.898～0.948；β地贫阳性确诊组171例HbA水平为（9.83±4.30）%，阴性对照组749例HbA水平为（21.05±8.37）%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05，t=22.315）。当HbA值为13.15时，敏感性为84.7%，特异性为85.6%，约登指数最大，为0.703。见图1。

图1 HbA指标筛查β地贫ROC曲线

2.4 其他异常血红蛋白带结果

其他异常血红蛋白带阳性共77例，初筛阳性率为0.77%，召回55例，召回率为71.43%（55/77），主要以N11区异常血红蛋白带和HbE为主；48例进行常规基因诊断，阳性17例，见表4。

3 讨论

地贫在我国南方为高发性遗传性疾病，静止型和轻型α地贫患者因无明显临床症状很易漏诊，多数中间型α地贫患者有临床贫血症状甚至需要输血治疗，重型α地贫为胎儿水肿综合征极易致死，重型β地贫表现为严重溶血性贫血，须进行输血以维持生命，缺乏有效的地贫根治办法是目前面临的一个重大公共卫生难题，严重威胁人类健康，给地贫患者家庭和社会带来了沉重的经济负担[3-4]。

表4 异常血红蛋白带结果

基因测序是诊断地贫的金标准，因其实验条件、检测成本高，无法大规模开展筛查，需寻找性价比高且可大规模开展的筛查方法[6-9]，干血斑全自动毛细管血红蛋白电泳法具有较高的敏感性及特异性，结果较为准确，经济方便，可大范围筛查，该技术是目前筛查新生儿地贫的有效方式之一[10-11]。本研究对顺德区新生儿采用全自动毛细管血红蛋白电泳技术进行地贫筛查，并以基因结果为参照进行分析，其阳性初筛率为14.52%，低于茂名地区的16.54%[12]，高于东莞地区的10.19%[13]；α地贫基因阳性率和符合率分别为5.33%和87.81%；β地贫基因阳性率和符合率分别为1.71%和69.51%，初筛阳性结果与基因检测结果之间的一致性较好。

研究结果还显示，本地区α地贫主要基因型为--SEA、-α3.7和-α4.2，与梁玉全等[14]的研究一致；β地贫基因型以βCD41-42为主，与万志丹等[15]的研究一致；确诊率低于全国平均水平，说明不同地区之间地贫发病率存在差异[3-4]；部分家属通过咨询了解得知轻型地贫危害性不大，考虑到婴儿尚小不愿再次抽血复查，使确诊病例减少，确诊率偏低。

HbBart's含量为0.1%的标本共42例，是结合母亲血常规MCV、考虑到静止型地贫缺乏临床症状容易漏筛，人工判读初筛阳性，而召回基因检测结果全部为阴性，说明仪器自动判读阴性结果准确性较高；HbBart's含量大于1.0%而常规地贫基因阴性标本有6例，考虑为罕见型地贫，建议家属进行罕见地贫基因检测或基因测序；仪器自动判读阳性标本基因确诊符合率达94.34%，说明毛细管电泳法具有较高的敏感性和特异性。

本研究共确诊β地贫171例，其中界值法初筛阳性174例，确诊108例，基因确诊符合率为62.07%，假阳性率达37.93%，主要集中在HbA含量为7.5% ～ 9.5%，其假阳性率达57.69%；导致假阳性增高的主要原因是部分临近足月新生儿电泳HbA偏低；综合分析法判读72例，确诊63例，基因确诊符合率为87.50%，假阳性率为12.50%；而两种方法结合应用明显提高了基因确诊率，达69.51%，降低了假阳性率，本研究结果与黄烁丹等[5]报道的一致。运用ROC工作曲线确定本实验室β地贫筛查HbA截断值，AUC为0.923，95%CI为0.898～0.948，当HbA值为13.15时，敏感性为84.7%，特异性为85.6%，约登指数最大为0.703，本研究得出的HbA截断值＞9.5，可能是因为研究标本量偏少，且其中部分筛查阳性是结合综合分析法判读而来，从而导致HbA阈值升高，今后将持续改进，累计实验数据，优化HbA截断值。

异常血红蛋白带主要以N11区和HbE为主，常规基因诊断阳性17例，由于本院未开展罕见型地贫基因检测和基因测序，考虑到多数异常血红蛋白并不致病，多数家属放弃进一步基因测序，通过知情告知和自愿原则，本研究外送三份异常血红蛋白阳性标本，结果检测到Hb G-Honolulu、Hb J-Wenchang-Wuming、Hb Queens各1例。

综上所述，全自动毛细管电泳法筛查联合地贫基因检测，能有效检出本地区新生儿地贫患儿；本地区新生儿地贫发病率高，在预防干预中应给予高度重视；由于人力、时间及技术水平等的限制，以及标本来源仅限于本院，研究结果可能会存在一定的偏差，针对存在的问题，研究小组将结合本地区实际情况逐步进行完善，促进研究水平，争取将该项目进行全区推广，为本地区新生儿地贫的诊断和预防保健工作提供科学数据。