四种石斛的薄层鉴别及多糖含量测定

张 婷 刘安韬 刘喜华 滕建北

1.广西卫生职业技术学院药学系中药教研室，广西南宁 530023；2.广西中医药大学药学院中药鉴定教研室，广西南宁 530001

石斛药材为兰科植物金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum Lindl.、流苏石斛Dendrobium fimbriatum Hook.的栽培品及同属植物近似种的新鲜或干燥茎[1]。最早见于《神农本草经》，具有益胃生津、滋阴清热之功效。研究表明石斛含多糖、生物碱、酚类等多种有效成分，其中石斛多糖具有增强机体免疫力功能[2]、防止机体氧化衰老、降低血糖血脂与抗炎等药理作用，临床上主要用于肿瘤、糖尿病、循环系统疾病等[3-17]，具有良好的应用开发前景。但石斛药材来源复杂，性状与显微特征较为相似，为保证石斛用药安全，本文对石斛的四种常用种类美花石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛进行了薄层色谱鉴别研究，并建立了这四种石斛多糖含量测定方法，对比了四种石斛的多糖含量差异，为这四种石斛的质量研究和产品开发提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

UV-2600 紫外可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]；SQP 型分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KQ-500DA 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SIM-F140AY65-PC 制冰机（日本，松下电器产业株式会社）；Direct-Q5UV纯水仪（默克密理博）；BSA224S 分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；Medifuge 离心机（赛默飞世尔科技中国有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科技仪器有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；H22-X3 红外炉（杭州九阳生活仪器有限公司）；DFY-500 打粉机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试药

50 mm×100 mm 硅胶G（青岛海洋化工有限公司）；0.3 mm×100 mm 毛细管（上海长城科学仪器商店经销）；GUZ3-J387 毛兰素（中国食品药品检定研究 院，111874-201603）；LM76-PSS7 石 斛酚（中国食品药品检定研究院，111875-201202）；LDOU-02FZ 石斛碱（中国食品药品检定研究院，111876-201503）；碘（天津市大茂化学试剂厂，CAS NO：7553-56-2）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 实验材料

美花石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛原生药材（采自广西河池市宜州区），经广西中医药大学中药鉴定教研室滕建北教授鉴定为兰科石斛属植物美花石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的茎。

1.4 统计学处理

通过SPSS 19.0 统计学软件对四种石斛的多糖含量进行均值、方差统计处理。显著性检验为F检验，置信水平为95%。

2 薄层色谱鉴别

2.1 供试品溶液的制备

精密称取美花、金钗、鼓槌石斛三种药材粉末（过三号筛）各1 g 和流苏石斛粉末（过三号筛） 0.5 g，参照《中华人民共和国药典》2015年版一部[1]薄层色谱法（通则0502）试验。

2.2 对照品溶液的制备

精密量取2 ml 甲醇溶液加入2 mg 石斛碱瓶中，配制成每1 ml 溶液里含1 mg 石斛碱作为对照品；精密量取2 ml 甲醇溶液加入0.4 mg 毛兰素瓶中，配制成每1 ml 溶液里含0.2 mg 毛兰素作为对照品；精密量取2 ml 甲醇溶液加入0.4 mg 石斛酚瓶中，配制成每1 ml 溶液里含0.2 mg 石斛酚作为对照品。

2.3 薄层色谱条件及薄层鉴别

将供试品及对照品溶液各10 μl 点于同一硅胶G 板，（60～90℃）石油醚-丙酮（7 ∶3）温度28.6℃湿度50%～60%。展开（展距约为8 cm），碘熏显色。薄层色谱图见图1。

由图1 可知，四种石斛的斑点与石斛碱对照品斑点均相对应，说明石斛碱在四种石斛中均存在；其中鼓槌石斛和流苏石斛斑点颜色相对较浅，说明其含的石斛碱含量较低；在毛兰素斑点相应位置中，其他三种石斛均没有显出斑点，仅鼓槌石斛在相应位置有斑点，说明毛兰素成分在四种石斛中仅鼓槌石斛含有；与石斛酚斑点可对应的有美花石斛、金钗石斛和鼓槌石斛，说明石斛酚成分在此三种石斛中均含有。

3 四种石斛多糖含量测定

3.1 标准品溶液的制备

用分析天平精密称定0.009 g D-无水葡萄糖标准品置100 ml 容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度线，配制成每1 ml 含90 μg（即0.09 mg/ml） 的对照品溶液，即得。

3.2 供试品溶液的制备

精确称取金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛粉末、美花石斛粉末（过三号筛）各0.3 g 各平分六份，置250 ml 锥形瓶中，加蒸馏水250 ml，加热回流2 h 后，待冷却后加纯水补重。过滤，精密吸取2 ml 续滤液，置于刻度为15 ml 的离心管中，加入无水乙醇10 ml，摇匀后、冷藏1 h 后，离心（转速为4000 r/min）20 min，沉淀再加8 ml 的80%乙醇洗涤2 次，离心10min，沉淀加热水溶解，转移至5 ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，即得。

3.3 显色测定方法

精密量取1 ml 的供试品溶液，依次放置于25 ml具塞试管中。精密加入5%苯酚溶液1 ml，充分摇匀。精密加入浓硫酸5 ml，置沸水中加热20 min 后，立即放入冰浴中冷却5 min。

另精密量取2 ml 蒸馏水，以相同方法，作为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在485 nm 波长处测定吸光度。

3.4 波长检测

精密量取供试品溶液1 ml，以D-无水葡萄糖溶液作对照，在紫外-可见分光光度仪器全波长进行扫描，蒸馏水作为空白。结果供试品与对照品最佳吸收波长为485 nm，因此确定485 nm 为检测波长。

3.5 线性关系考察

分别精密吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 加入20 ml 具塞试管中，按照“3.3 项下”显色。照紫外-可见分光光度法，在485 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（y），葡萄糖浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。得到线性回归方程y=10.044x+0.0063，R=0.9994，实验结果表明，葡萄糖的浓度在0.009～0.090 mg/ml 范围内线性关系良好。

3.6 精密度实验

精密吸取1 ml 供试品溶液，照紫外-可见分光光度法，检测方法同“3.5”项下，连续测定6 次，精密度试验的RSD 结果为0.52%，精密度良好。

3.7 稳定性试验

精密吸取1 ml 供试品溶液，检测方法同“3.5”项下，分别在0、10、20、30、40、50、60、90、120 min 时测定其吸光度，连续测定2 h。鼓槌石斛多糖RSD值为0.78%。

3.8 重复性试验

称取鼓槌石斛粉末，过3 号筛，精密称定0.3 g，按“3.2”项下制备供试品溶液，精密量取1 ml，放入具塞试管中，按照“3.5”项下方法测定，结果显色RSD 值为2.07%。

3.9 加样回收率试验

精密称定D-无水葡萄糖0.83 mg，加入蒸馏水溶解，定容至25 ml 容量瓶。取6 支20 ml 具塞试管，精密量取葡萄糖对照品0.5 ml，再量取“3.2”项下的鼓槌石斛的供试品溶液0.5 ml，照“3.3”项显色测定吸光度计算回收率，平均加样回收率为100.40%，RSD 值为3.10%。

3.10 样品的测定

分别精密称取四种石斛供试品溶液（每个样品平行6 次），按“3.5”项下进行吸光度测定，计算多糖含量（表1）。

由表1 可知，美花石斛多糖含量高于其他三种石斛，鼓槌石斛多糖含量低于其余三种；四种石斛的多糖含量由大到小依次为美花石斛＞金钗石斛＞流苏石斛＞鼓槌石斛（24.02%＞13.48%＞8.55%＞6.55%）。

表1 四种石斛的多糖含量测定结果（n=6）

四种石斛多糖差异有统计学意义（P＜0.05），说明四种石斛的多糖含量差异都极显著。

4 讨论

薄层色谱（TLC）也叫薄层层析，因分离是在一平面薄层上进行而得名。因其快速、简便和微量的特点而得到广泛应用，薄层色谱的基本原理是利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在流动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。薄层色谱法是目前中药材鉴别常用的鉴别方法，具有操作简便、直观、分辨力高、适用性强等优点，在《中华人民共和国药典》（2015年版）[1]中被广泛采用[10-11]。

鉴于石斛种类较多[9]，性状与显微特征较为相似，难以正确鉴别石斛药材，因而本研究采用薄层鉴别法对四种石斛进行鉴别研究，实验结果表明毛兰素可作为鼓槌石斛的鉴别成分，填补了目前石斛的薄层鉴别研究[18-19]的空白，且专属性良好。

中药中的多糖类成分具有丰富的药理活性，如猪苓多糖、香菇多糖等有抗肿瘤的作用，人参多糖有增强免疫的作用[20]，石斛多糖具有抗衰老、增强免疫力[20-21]、抗肿瘤[22]等作用，多糖一般由D-葡萄糖，D-阿拉伯糖和D-半乳糖等聚合而成，因其在强酸中反应成醛，进一步与酚类缩合产生特有的有色物质，因此硫酸蒽酮法和盐酸苯酚法可以用来测定多糖的含量，研究表明硫酸苯酚法较为稳定，作为多糖含量测定的方法更为理想[20]。本实验选取石斛鲜茎，采用盐酸苯酚法进行多糖含量的测定，采用合理的定容方式，准确测定了金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的多糖浓度，为石斛质量评价提供依据。