RRS1对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、转移和侵袭的影响

潘展砚 吴 琼 王岚琦 胡婷婷 鞠 强

上海交通大学医学院附属仁济医院皮肤科，上海，200127

皮肤癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率远高于肺癌、肝癌等内脏肿瘤[1]。皮肤鳞状细胞癌发病率较高，容易转移，对患者的生命带来巨大的威胁。寻找与皮肤鳞状细胞癌(cSCC)增殖、转移相关的功能基因，给对cSCC的早期诊断和精准治疗有重要意义[2]。核糖体合成调控因子1(RRS1)参与rRNA的加工及核糖体生物合成。研究显示，RRS1基因在许多人类肿瘤中过表达，如宫颈癌、甲状腺乳头状癌、肝癌、结直肠癌和乳腺癌等，并在肿瘤发生发展中起到重要作用[3-6]。但是RRS1在皮肤肿瘤上的相关研究未有报道。本研究通过对临床标本的免疫组织化学研究RRS1在cSCC的表达，RRS1基因敲低的方法研究其对人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖、转移的影响。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集2014年9月至2019年6月来自上海交通大学附属仁济医院皮肤科和整形外科手术存档蜡块，其中正常皮肤15例，cSCC 15例。以上标本均经病理检查证实，且所有病例手术前均未经化疗、放疗及其他免疫治疗。正常对照组，男8例，女7例，年龄59～85岁，平均(70.00±8.09)岁；cSCC组，男8例，女7例，年龄67～88岁，平均(71.87±8.35)岁。cSCC组与对照组的年龄及性别等差异均无统计学意义，具有可比性。

1.2 材料和试剂 兔抗人RRS1抗体购自美国abcam公司(ab188161)，GADPH抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒(鼠/兔)、粉剂型柠檬酸抗原修复液、粉剂型 PBS磷酸盐缓冲液购自福建迈新公司。人鳞状细胞癌细胞系 SCL-1(中国科学院上海细胞库)。DMEM培养基、胰蛋白酶消化液(美国HyClone公司)，胎牛血清(中国山东博康公司)，青链霉素混合液(中国北京索莱宝公司)，转染试剂Lipo2000、Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)，RRS1干扰慢病毒、GV115质粒(中国上海吉凯公司)，Matrigen基质胶(美国BD公司)，Transwell小室(美国Millipore公司)，RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 免疫组织化学染色和结果判断 将所有标本以4 μm厚度连续切片，将组织切片常规脱蜡。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用试剂公司提供的已知阳性切片作为阳性对照。所有标本用柠檬酸修复抗原。滴加一抗，37℃孵育60 min；PBS 缓冲液冲洗3 min×3次，滴加二抗，室温孵育30 min，PBS缓冲液冲洗3 min×3次，滴加新鲜配制的DAB显色，镜下控制显色时间，及时终止显色; 依次苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，风干，树脂封片。结果判断：RRS1以肿瘤细胞核出现棕黄色颗粒为阳性信号。采用双育法，每例均随机观察5个高倍视野(×400)，以显色强度和阳性细胞百分率作为评价标准。采用半定量法判断结果:阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分，>75%为4分;阳性强度:无染色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞数分和阳性强度分相乘,0分为(-),1～4分为(+),5～8分为(++),9～12分为(+++)。

1.4 慢病毒的构建 从NCBI中获取RRS1基因的全部序列，由上海吉凯公司合成荧光标记的慢病毒，选择编号为GV115的质粒载体。设计多个RNA干扰靶点序列，经过评估测定后，选用RRS1干扰靶点序列为：GCTGCCTTCATTGAGTTTA。荧光标记的慢病毒感染细胞，检测病毒感染SCL-1细胞的滴度。

1.5 细胞培养及处理 使用含有10%胎牛血清和0.01%青链霉素溶液的DMEM培养基常规培养 SCL-1细胞。传代后，在6孔板中培养 SCL-1细胞，当汇合率到70%左右时，加入病毒，确保病毒感染效率在80%左右。SCL-1细胞感染慢病毒空载体为Mock组，感染慢病毒shRNA-RRS1为shRNA组。

1.6 QRT-PCR检测 使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从细胞中提取总RNA。RNA浓度通过NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)测定。根据制造商的规程，使用First-Strand cDNA Synthesis试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)对20～100 ng RNA进行逆转录。在LightCycler 480系统(上海罗氏诊断产品有限公司)上进行qRT-PCR，并用于分析mRNA的表达水平。使用GAPDH作为内部对照，计算基因的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR的引物序列

1.7 Western blotting实验 收集各组细胞，每组加入200 μL 的裂解液，置于冰上充分裂解 30 min，收集细胞裂解液，12000 rpm、4℃条件下离心12 min，收集上清液。BCA法检测上清液中总蛋白浓度，每孔上样40 μg进行电泳分离，恒压70 V，电泳3 h。然后转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，将印迹膜放入对应的一抗溶液(稀释比1∶1000) 中，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，再把条带放入盛二抗(稀释比1∶1500) 的平皿中室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入4 mL的ECL显影液显色3 min，凝胶成像系统曝光。

1.8 MTT法检测细胞增殖 shRNA-Mock组、shRNA组细胞。将细胞接种于96孔培养板，细胞数为1×105/mL。培养8～12 h细胞长至单层后，并加入5 mg/mL的MTT 10 μL，5% CO2孵育4 h，每孔加入二甲基亚砜100 μL，常温下，摇匀10 min，酶标仪测490 nm波长下的吸光度A值，表示细胞活性，两组均设6个实验孔，实验重复3次。

1.9 Celigo划痕实验分析RRS1基因对SCL-1细胞迁移能力的影响 SCL-1细胞细胞转染慢病毒48 h后，待组细胞生长至对数生长期，铺96孔板，用划痕仪在培养皿刮擦细胞以产生划痕区域，并用无血清培养基彻底冲洗以除去所有细胞碎片。然后在96孔板中加入培养基。使用Celigo细胞仪(美国Nexcelom公司)拍摄并检测细胞荧光。Celigo细胞仪自动计算迁移面积，迁移率为迁移细胞面积(9 h)/划痕面积(0 h)×100%，实验重复3次。

1.10 Transwell实验分析RRS1基因对SCL-1细胞侵袭能力的影响 Matrigen基质胶包被Transwell小室基底膜。SCL-1细胞细胞转染慢病毒48 h后，待组细胞生长至对数生长期，将细胞种于24孔板并且置于Transwell小室中，上室加入0.1 mL无血清培养基，下室加入0.5 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养24 h，观察细胞迁移情况。取出Transwell小室用PBS洗2次，甲醛固定，用吸水纸吸去上室培养基，滴结晶紫在小室下表面进行染色，5 min后，冲洗结晶紫，空气晾干后显微镜下进行拍照(×100)，实验重复3次。

1.11 GEO肿瘤数据库分析RRS1在cSCC中的表达 GEO肿瘤表达数据库含有一项正常皮肤(6例)和皮肤鳞状细胞癌(5例)表达谱数据(GDS2200)，可查得RRS1在各样本中mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 RRS1在cSCC和正常皮肤中的表达 GEO肿瘤表达数据库(GDS2200)显示RRS1在cSCC组相对表达均值为3342.36±1312.33，在正常皮肤组为1458.55±504.02，P<0.01。免疫组织化学结果显示RRS1在正常皮肤、cSCC中表达于细胞核。图1示RRS1在cSCC表达显著高于正常皮肤(P<0.01)(表2)。

表2 RRS1免疫组织化学染色结果

图1 1a:正常皮肤RRS1主要表达在皮肤细胞核中，表达评分为+(免疫组化，×200);1b:cSCC皮损RRS1主要表达在肿瘤细胞核中，表达评分为+++(免疫组化，×200)

2.2 RRS1对SCL-1细胞增殖的影响 QRT-PCR检测结果显示感染慢病毒后，RRS1的敲减效率达到74%。Western blot结果证实RRS1被成功敲减(图2)。细胞铺于96孔板。MTT连续检测5天，发现shRNA组相比shRNA-Mock组的细胞增殖速率受到显著抑制。图2提示RRS1基因与SCL-1细胞的增殖能力显著相关。

2.3 RRS1对SCL-1细胞增殖的转移和侵袭性的影响 划痕实验结果表明，shRNA组细胞迁移率为(45.79±1.10)%，Mock组细胞迁移率为(64.56±3.33)%，P<0.01。shRNA组细胞迁移率与Mock组细胞相比明显降低。Transwell结果表明，shRNA组侵袭细胞数为105±2.51，Mock组175±5.41，P<0.01。shRNA组细胞侵袭能力与Mock组细胞相比明显降低(图2)。

2a:QRT-PCR检测结果显示感染慢病毒后，RRS1的敲减效率达到74%。Western blot结果证实RRS1被成功敲减;2b:MTT连续检测5天，发现shRNA组相比Mock组的细胞增殖速率受到显著抑制;2c:两组细胞Transwell实验24小时拍摄的显微镜照片(×100);2d:两组细胞在0小时和9小时，Celigo细胞仪拍摄并检测细胞荧光照片(×100);2e:Transwell结果表明，shRNA组侵袭细胞数为105±2.51，Mock组175±5.41;2f:划痕实验结果表明，shRNA组细胞迁移率为(45.79±1.10)%，Mock组细胞迁移率为(64.56±3.33)%。**与Mock组相比P<0. 01

2.4 RRS1对增殖、转移和侵袭相关基因表达的影响 QRT-PCR检测结果显示，增殖相关基因FGF2，AREG，cyclin E1在shRNA组显著降低，P<0.01。转移和侵袭相关基因VIM、CXCL1、CXCL3、CXCL8、MMP1在shRNA组显著降低，P<0.01(表3)。

表3 RRS1敲低后细胞相关基因表达变化

3 讨论

核糖体合成调节因子1(RRS1)是由203个氨基酸组成的核蛋白，对于核糖体合成至关重要，它可以根据细胞状态调节核糖体合成速度，然后维持细胞稳态。RRS1的异常表达对核糖体的合成有负面影响，导致核糖体的生理功能异常[7]。一些研究显示恶性肿瘤的发生、发展与RRS1的异常表达密切相关。Song等[8]使用RNA干扰技术来降低RRS1基因的表达水平，发现细胞分裂时间明显延长，表明乳腺癌细胞中RRS1基因的表达水平与细胞增殖有关。Wang等[5]发现肝癌组织中与RRS1基因表达水平显著高于癌旁组织，且RRS1基因与肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移相关。最近的研究表明，RRS1在结肠癌中过表达，并且与肿瘤增殖有关[6]。有研究显示，在细胞和动物模型上，长非编码RNA可以通过抑制RRS1的表达从而抑制乳腺癌的形成和进展[9]。MicroRNA-598也可以通过下调RRS1的表达来抑制胃癌细胞的生长[10]。因此认为RRS1基因是肿瘤治疗中的新的潜在靶标。

RRS1在皮肤肿瘤中的研究还未见相关报道。本研究免疫组织化学结果显示，RRS1在人正常表皮和cSCC皮损中均有表达，显示RRS1在皮肤细胞中有生理学功能。RRS1在cSCC皮损中的表达高于正常皮肤，GEO的表达数据库数据也证实了这个结果，提示RRS1的高表达与cSCC的发病高度相关。我们用皮肤鳞癌SCL-1细胞进一步探索了RRS1的功能作用，结果显示慢病毒敲低RRS1后，SCL-1细胞的增殖活性、转移和侵袭能力均大幅度降低。这些结果均提示RRS1在肿瘤增殖、侵袭和转移中起到重要作用。降低肿瘤细胞内RRS1的表达，可能成为防治cSCC的新策略。

我们初步探索了RRS1的作用机制。结果显示RRS1敲低后，肿瘤增殖相关基因FGF2、AREG、cyclin E1表达降低。FGF2和AREG是癌基因，与肿瘤细胞的增殖密切相关，也是肿瘤微环境的关键调节因子[11]。Cyclin E1是细胞周期调节蛋白，其过量表达可使CDK2持续激活，从而使细胞异常增殖导致肿瘤发生。RRS1敲低后，转移和侵袭相关基因VIM，MMP1、CXCL1、CXCL3、CXCL8表达也显著增高。VIM(波动蛋白)表达增高与肿瘤的局部转移和远处转移密切相关[12，13]。多个基因芯片研究显示MMP-1是cSCC疾病的关键基因，可以预测疾病的转归和预后[14]。CXCL1、CXCL3、CXCL8是趋化因子家族成员，与cSCC的侵袭和转移相关。RRS1敲低后这些基因表达的改变，解释了其对肿瘤细胞增殖活性、转移和侵袭能力作用的机制。

综上所述，RRS1在cSCC中表达明显增高。RRS1可调控肿瘤细胞增殖活性、转移和侵袭能力。RRS1表达影响了肿瘤细胞增殖、转移和侵袭能力的相关基因。进一步研究需要明确RRS1与cSCC分期和疾病转归的关系，明确RRS1具体作用机制，明确调控RRS1表达的因素。使RRS1成为cSCC新的生物学标志和治疗靶点。