银耳子实体及菌丝体胶质化产生的双核酵母状孢子萌发条件探索*

陈利丁，刘云超，孔旭强，张琪辉，纪君仪，李 帆，孙淑静**

（1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2.古田县食用菌研发中心，福建 宁德 352200）

银耳（Tremella fuciformis），俗名白木耳，主要分布于亚热带地区，属于中温好气性真菌[1]。银耳生活史由担孢子萌发开始至下一代担孢子成熟结束[2]，担孢子萌发产生萌发管或继续无性分裂产生酵母状分生孢子，萌发管延伸形成单核菌丝[3]，相邻的2种单核菌丝在生长蔓延过程中互相结合形成双核菌丝[2]；双核菌丝继续扭结形成白毛团，后逐渐胶质化形成原基；原基在适宜条件下，继续生长为子实体，子实体成熟后，会弹射大量的担孢子，完成一个完整的生活史[2]。来源于子实体、菌丝体胶质化产生的双核酵母状孢子（dikaryotic yeast-like spores from fruiting body and mycelia，FBMds） 是银耳生活史的一个特殊形态，是银耳在菌丝体阶段、子实体阶段由于在湿度过大（游离水过多）、温度过高、机械碰撞等诸多不利环境下产生的一种应激性反应[2-3，6]，FBMds在一定条件下又可萌发形成菌丝，这在真菌学上称为“二型现象”[4]。很多学者认为FBMds是菌丝断裂形成的节孢子[4-5]，钟德义[6]认为FBMds与菌丝的胶质化程度有关，而不是简单的菌丝断裂。

通常情况下，银耳一旦转变为FBMds，就很难再恢复为菌丝或子实体形态[8]。正是因为银耳具有这个特性，在生产、保种过程中，一旦银耳被发现形态发生转变，便遭废弃。但酵母态的银耳FBMds具有恢复为菌丝或子实体形态的潜能[3]，由FBMds萌发形成的菌丝具有极高的纯度，若能稳定传代，将在育种、保种、基因功能研究等工作中发挥巨大优势。然而，目前如何使银耳FBMds由酵母态转变为菌丝态的报道尚不多，而关于银耳FBMds萌发效果的研究较为薄弱，萌发率不高，菌丝的产生带有较大随机性。在诸多环境因素中，香灰菌浸提液是影响银耳FBMds萌发的重要因素[5]，同时在特定的固体培养基中，银耳FBMds也可以产生银耳菌丝[9]，但时间长，效率低。如何进一步提高银耳FBMds的萌发率，使其在较短时间内转变为银耳纯菌丝，并可以继续稳定传代，对研究银耳二型态、银耳菌种纯化、新品种选育具有重要意义。在前人研究基础上，以银耳Tr21 FBMds菌株为材料，探究在固体培养条件下香灰菌浸提液、银耳孢子发酵液对银耳Tr21 FBMds萌发的影响，以期得到具有较高萌发率的FBMds及能够稳定传代的银耳纯菌丝。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

研究中所采用的8株银耳孢子供试菌株、5株香灰菌供试菌株的名称和来源见表1。

表1 供试菌株及来源Tab.1 Strains and sources

1.2 试剂与仪器设备

葡萄糖、KH2PO4购自西陇科学股份有限公司；麦芽糖、MgSO4·7H2O购自国药集团化学试剂有限公司；（NH4）2SO4购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司，以上试剂均为分析纯；酵母粉、蛋白胨购自广东环凯微生物科技有限公司；琼脂购自北京索莱宝科技有限公司。

B-190TB正置生物显微镜，德国OPTIKA公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司；ZHWY-2102恒温培养震荡仪，上海智诚分析仪器制造有限公司；XY-110MW含水量测定仪，常州幸运电子设备有限公司。

1.3 培养基配方

PDA加富培养基（1 L）：土豆200 g、葡萄糖20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO41.5 g，ddH2O 1 000 mL。

TSG 促萌发培养基 （1 L）：MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO41 g、KH2PO41.5 g、葡萄糖 10 g、麦芽糖10 g、琼脂粉30 g，香灰菌浸提液400 mL，ddH2O定容 1 000 mL。

PDA加富固体培养基（1 L）：土豆200 g、葡萄糖 20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，ddH2O 1 000 mL。

木屑培养基：木屑67%、麸皮30%、葡萄糖2%、石膏1%，料水比1∶1.3。

空白培养基（1 L）：麦芽糖10 g、葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO41 g、KH2PO41.5 g、琼脂粉 30 g，补水至 1 000 mL[7，11]。

1.4 香灰菌浸提液与银耳孢子发酵液的制备

1.4.1 香灰菌浸提液制备

用无菌接种钩从试管中钩取香灰菌接种块至PDA加富固体培养基正中央，24℃活化7 d，用6 mm打孔器在长好的香灰菌上打孔，再用无菌接种钩挑取1块放在木屑培养基正中央，24℃培养30 d，调整培养基含水量为60%，准确称量300 g含有香灰菌的木屑培养基，加水1 500 mL沸水浴30 min，4层纱布过滤2次，加水定容至1 L。

1.4.2 银耳孢子发酵液的制备

用无菌接种环从试管中刮取一环银耳孢子并划线至PDA加富固体培养基上，24℃活化7 d，将不同来源活化好的银耳孢子接种到PDA加富培养基中，25℃摇床培养7 d，600 nm下测定发酵液OD值（光密度值），用无菌水将不同孢子发酵液OD值调整至基本一致，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液，过滤除菌（滤膜孔径0.45 μm）。

1.5 影响银耳Tr21 FBMds萌发率的因素研究

1.5.1 不同浓度香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响

制备香灰菌HTW01-5的浸提液，向TSG培养基及空白培养基中添加香灰菌浸提液，使TSG培养基香灰菌终浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%，制备成含有不同浓度香灰菌浸提液的萌发培养基，121℃灭菌20 min，保存备用。将银耳双核酵母状孢子Tr21 FBMds划线至不同浓度的TSG培养基上，25℃培养，从第3天开始取样镜检、计数，统计萌发为菌丝的FBMds数与未萌发的FBMds数，计算FBMds萌发率。萌发率（GR，%）计算公式为：

式中：A1为萌发的FBMds总数；A2为未萌发的FBMds总数。

1.5.2 不同来源香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响

制备不同来源香灰菌的浸提液，向空白培养基中添加由1.5.1得出的最佳香灰菌浸提液添加浓度。制备含有不同来源香灰菌浸提液的TSG培养基，121℃灭菌20 min，保存备用。将银耳Tr21 FBMds划线至培养基上，25℃培养，从第3天开始取样、镜检并计算FBMds萌发率。

1.5.3 不同来源银耳孢子发酵液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响

制备空白培养基，补水至800 mL，每个三角瓶（250 mL） 分装80 mL，121℃灭菌20 min，保存备用。加热融化培养基，待培养基温度下降到60℃左右，每瓶加入20 mL不同来源的孢子发酵液，制备成终浓度为20%的孢子发酵液-萌发培养基（FSG培养基），直接倒平板备用。接种银耳Tr21 FBMds，25℃静置培养，从第3天开始取样、镜检并统计FBMds萌发效果。

银耳孢子发酵液的促萌发效果采用相对程度用0～1描述，对照为空白培养基添加培养孢子的PDA加富培养基，根据菌丝团大小及数量特征进行相关统计。

1.6 统计学处理

不同浓度香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响、不同来源香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds的影响试验中，萌发率统计取3个重复，单因素方差分析均采用IBM SPSS Statistics 19.0软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同浓度香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响

不同浓度香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响见图1。

图1 不同浓度香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响Fig.1 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由图1所示，香灰菌浸提液浓度对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响极大。由第3天Tr21 FBMds萌发率的平均值可知，在一定浓度范围内银耳Tr21 FBMds的萌发率随香灰菌浸提液浓度的增大而提高。其中含40%香灰菌浸提液的培养基FBMds萌发率最高，萌发率为30.12%。香灰菌浸提液的浓度超过40%后，FBMds萌发率无显著提高。不同浓度香灰菌浸提液银耳Tr21 FBMds的萌发情况见图2。

图2 不同浓度香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发的影响Fig.2 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由图2可知，从第5天开始，萌发的菌丝会聚集成菌丝团，无法通过震摇、吹打等方式将之分散开，对计数造成较大影响。随着FBMds培养时间的延长，从显微形态上看，萌发的FBMds会不断聚集成菌丝团，且菌丝团会逐渐变大；从菌落形态看，平板菌落随培养时间的延长，菌落逐渐变大，表层逐渐失水变干，菌落不断收缩，最终呈沟壑状，培养到第7天，部分平板菌落边缘开始出现茸毛状菌丝，再继续培养，菌丝不会增多。显微镜下银耳Tr21 FBMds的不同形态见图3。

图3 显微镜下银耳Tr21 FBMds的不同形态Fig.3 Differentmorphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds under microscope

由图3镜检结果可知，FBMds具有瓜子状、椭圆状和圆形3种形态。FBMds萌发时一头伸出芽管，呈蝌蚪状；随后芽管逐渐延伸、变长甚至分叉，萌发的FBMds逐渐聚集成团，相邻菌丝发生交合；分叉芽管、成团菌丝在显微镜下，可以观察到明显的锁状联合。萌发后的银耳Tr21 FBMds菌丝生长情况见图4。

图4 萌发后的银耳Tr21FBMds在新的TSG培养基上的菌落形态Fig.4 Colony morphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds after germination on new TSG medium

由图4可知，萌发后的FBMds菌落接种至新的TSG培养基后，开始大量芽殖，待长到一定大小后，菌落周围产生白色致密菌丝。待菌落周围菌丝长至一定面积后，对菌丝区域打孔并于新的TSG培养基上继续传代，可得到不含双核酵母状孢子的银耳纯菌丝。

2.2 不同来源香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响

不同来源香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响见图5。

图5 不同来源香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响Fig.5 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由图5所示，不同来源的香灰菌对银耳Tr21 FBMds的促萌发作用也不同。在香灰菌浸提液浓度不变的情况下（浓度40%），加入与银耳Tr21伴生的原始香灰菌HTW01-5浸提液，银耳Tr21 FBMds的萌发率最高，为30.34%，与不同来源、相同香灰菌菌种HTY01-SC、HT01-TH的浸提液对Tr21 FBMds萌发率的影响无显著差异。显微镜下其萌发情况见图6。

由图6可知，随着培养天数的增加，不同香灰菌浸提液均可促进FBMds萌发，且菌落形态均逐渐变大、变干燥、沟壑状菌落愈发明显。从第7天开始，Tr21 FBMds均能够形成面积较大的菌丝团。

图6 不同来源香灰菌浸提液对银耳Tr21 FBMds萌发的影响Fig.6 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

2.3 不同来源银耳孢子发酵液对银耳Tr21 FBMds萌发率的影响

银耳孢子发酵液也是影响银耳Tr21 FBMds萌发率的重要因素之一。不同来源银耳孢子发酵液对银耳Tr21 FBMds萌发的影响见图7。

如图7所示，不同来源的银耳孢子发酵液均能在一定程度上提高银耳Tr21 FBMds的萌发率。其中T30-CAS孢子发酵液的影响效果最为显著，接下来依次为 Tr01、Tr21、T8225-CAS，均能够形成大面积的菌丝团，见图8。

图7 不同来源银耳孢子发酵液促FBMds萌发效果Fig.7 Effect of different sources fermentation broth of Tremella fuciformis spores on FBMds germination rate

图8 不同FSG培养基中银耳Tr21FBMds镜检图与平板菌落形态Fig.8 Microscopic examination and plate colony morphology of Tr21 FBMds of Tremella fuciformis spores on different FSG medium

由图8镜检结果可知，银耳Tr21 FBMds在含TWY01-GP、T56-CAS孢子发酵液的FSG培养基中形成的菌丝团数量少、面积小、松散度高，且大部分是游离的芽管。比较香灰菌发酵液的促萌发效果，孢子发酵液中多为芽管形式存在，菌丝短，在含T30-CAS平板中有萌发程度高、菌丝团面积大的菌落，与其他平板比较，表面更加干燥，呈瘤状突起。将促萌发过的银耳Tr21 FBMds挑取较干燥部分并转接至添加了不同银耳孢子发酵液的FSG培养基上培养14 d，菌落呈现出不同的形态见图9。

图9 FBMds在不同FSG培养基上菌落形态Fig.9 Colony morphology of FBMds on different FSG media

由图9所示，在添加了TWW01-AX、TWY01-GP、T56-CAS孢子发酵液的FSG培养基上，部分位置的菌落外观干燥，另一部分菌落依旧呈湿润、饱满的状态；在含有促萌发效果较好的T30-CAS、Tr01、Tr21、T8225-CAS孢子发酵液的FSG培养基上，菌落呈半干的瘤状；促萌发效果越好，菌落越干燥，菌落收缩越明显。含有T30-CAS发酵液的FSG培养基上，仅有少部分平板菌落边缘会产生纤弱的菌丝。由此可见，不同银耳孢子发酵液促进FBMds萌发效果显著低于香灰菌发酵液。

3 讨论

当前银耳FBMds的产生对生产、保种而言均不利[8]。但是酵母态银耳FBMds具有恢复为菌丝态的潜能，能极大地提高银耳菌丝的纯度，在育种、保种、基因功能研究等工作中均具有较大应用前景。目前，常规的银耳品种选育方法工作量大、过程烦琐、育种效率低，而现代化的育种手段尚未取得实质性进展[11]。但无论是原生质体融合育种、诱变育种还是基因工程育种，其最终都要回归到FBMds的研究上。如何使FBMds由酵母态转变为菌丝态，是当前银耳领域需要关注的重点，也是当前银耳领域向前发展的突破口。

二形态现象在许多真菌中普遍存在，尤以病原真菌如热带假丝酵母[12]、白念珠菌[13]等最为典型。银耳作为二型性真菌，由于其酵母态细胞难萌发菌丝，相较于其他容易在二型态间转变的真菌，基础研究薄弱，未有突破性的进展[14]。银耳FBMds的萌发由芽管开始，萌发的芽管会伸长、分叉，并与其他萌发的银耳FBMds聚集交合，形成菌丝团，单个FBMds萌发后有锁状联合，这与单倍体的担孢子萌发的菌丝有本质区别。

银耳FBMds萌发与许多环境因素有关。刘娟等[5]认为氮源、碳源、培养时间、pH、温度和香灰菌的胞外液7种环境因素，均对银耳TrJ38 FBMds向菌丝形态转化有一定影响。其中过滤除菌后的香灰菌胞外液的添加对FBMds的形态转化影响最大，能使菌丝型银耳TrJ38的比率提高到9.89%，但认为FBMds形态的转变与香灰菌浓度无关。本研究在此基础上进行改进，揭示了不同香灰菌菌种及浓度对银耳Tr21 FBMds的萌发率的影响，香灰菌HTW01-5发酵液添加浓度为40%时，银耳FBMds萌发率达30.34%，同时发现银耳Tr21原始伴生的香灰菌HTW01-5促萌发作用最强。

在TSG培养基上，FBMds菌落由光滑、湿润的酵母状菌落逐渐失水、收缩、变干，最终形成干燥的沟壑状菌落，部分菌落周边长出少量肉眼可见的白色菌丝。FBMds菌落的干燥程度及收缩程度与FBMds萌发率息息相关，菌落表面越干燥、沟壑越明显，FBMds萌发率越高、菌丝团越大。若将萌发的FBMds转接至新的TSG培养基上，当FBMds菌落长至一定大小后，其周边长出大量肉眼可见的致密菌丝。除了香灰菌浸提液外，银耳孢子发酵液也具有促进FBMds萌发的作用。香灰菌浸提液与银耳孢子发酵液均可以显著促进银耳FBMds的萌发，但香灰菌浸提液的促萌发效果明显优于银耳孢子发酵液，添加了香灰菌发酵液的培养基所得的菌丝更加粗壮、浓密。

当前银耳育种主要是通过驯化野生种、不同来源银耳与香灰菌的配对选育。银耳杂交育种历史上也仅报道过2例[15-16]。究其原因主要是银耳纯菌丝较难获得，导致银耳只能通过较为原始的方法进行育种。本研究优化了银耳FBMds的萌发条件，能在不需要大量重复的条件下几乎能100%获得银耳纯菌丝，且该银耳纯菌丝具有传代能力，能继续在TSG培养基上维持稳定生长；此外，该方法得到的银耳纯菌丝能稳定与香灰菌在木屑培养基上配对出耳。银耳纯菌丝的易获得与稳定出耳为以菌丝为基础的杂交育种和以酵母态的FBMds为基础的诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种等现代化育种方式奠定了基础。同时，由FBMds萌发得到的菌丝相较于由子实体、白毛团得到的银耳纯菌丝纯度高，对菌种纯化工作具有极大意义。