地龙口服液对大鼠的亚慢性毒性试验

房春林，黄 兴，殷中琼

（1.成都农业科技职业学院，四川成都 611130；2.四川农业大学，四川成都 611130）

地龙（又名蚯蚓）为钜蚓科动物参环毛蚓PheretimaasPergilium（E．Perrier）、 通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓Pheretima Pectinifera Michalsen的干燥体，气腥，味咸，性寒，归肝、脾、膀胱经，具有清热平肝、定惊、消炎止痛、通络、平喘、利尿等作用。常用于治疗高热神昏、狂躁、肺热咳喘、尿少水肿[1～3]。现代医学研究证明其具有镇静、抗惊厥、解热、平喘、抗血栓、抗病毒等生物活性[4～6]。临床上可用于治疗癫痫、慢性支气管炎、支气管哮喘、微循环障碍等[7～8]。本研究的目的是在研究地龙口服液急性毒性的基础上，进一步对其进行亚慢性毒性试验研究，评价地龙口服液的安全性，为兽医临床用药安全提供参考依据。

1 材料

1.1 试验动物

4 周龄SD 大鼠80 只， 雌雄各半， 体重90 ～110 g。购于成都达硕实验动物研究所，合格证号：SCXK（川）2013-24。

1.2 药品

地龙口服液（含量：含原生药量为10 g/ml），由成都乾坤动物药业股份有限公司中试生产，生产批号：20200101。

1.3 主要试剂

血细胞计数配套试剂（稀释液、溶血素、清洗液等），购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

血液生化指标配套试剂盒（质控血清、ALP、TP、ALB、ALT、AST 、BUN、TG、TH0、GLU 等）,购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

甲醛、氯化钠、乙醇、肝素钠等，购自成都化学试剂厂。

1.4 主要仪器

离心机：EPPendorf5804；迈瑞血细胞分析仪：深圳迈瑞生物医学电子有限公司，BC-2800；迈瑞血液生化分析仪：深圳迈瑞生物医学电子有限公司，BS-180；显微镜：奥林巴斯；切片机：徕卡（2016）；电子天平：赛多利斯。

2 方法

2.1 试验分组

选用健康的SD 大鼠80 只（4 周龄，体重90 ～110 g），雌雄各半，随机分为4 组，设高、中、低剂量组和对照组，每组20 只。

2.2 给药剂量与给药途径

参照兽药研究技术指导原则汇编中亚慢性试验方法进行[9]，试验组设高中低剂量组分别为3125 mg/kg、1042 mg/kg、313 mg/kg，空白对照组每天给予等剂量的生理盐水。各给药组均按每组动物的平均体重分别计算出每天的给药量，灌胃针每天开水煮沸消毒，每天上午灌胃1 次，连续灌服30 d，自由采食饮水，停药后观察2 周。

2.3 临床表现观察

整个试验期间，每日早晚观察并记录大鼠被毛、眼、粘膜改变和呼吸系统、神经系统、肢体活动、行为方式等变化发生的时间、程度和持续时间。对发现的死亡动物或濒危动物进行及时剖检。

2.4 体重和摄食量

每日测量1 次饲料和饮水消耗量，每周测体重1 次。

2.5 血液学检查

给药结束后每组剖杀10 只大鼠，雌雄各半。大鼠眼眶静脉采血0.5 ml，注入真空肝素钠抗凝管中，进行血液生理指标的测定，检查指标包括血红蛋白（HGB）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）、白细胞（WBC）及分类计数中性粒细胞（GRA）、淋巴细胞（LYM）和单核细胞（MID），嗜酸性粒细胞（EO），嗜碱性粒细胞(BASO)。

2.6 血液生化检查

大鼠眼眶静脉采血2.0 ml，放入洁净离心管中，室温下静置析出血清，3500 r/min 离心10 min，收集血清进行血液生化指标的测定。检查指标包括白蛋白(ALB)、总蛋白（TP）、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（CHO）。

2.7 脏器系数测定

对所有大鼠进行大体解剖，检查体表、体腔的各开口处，颅、胸、腹腔及其内容物；心、肝、脾、肺、肾等脏器分离后尽快称重，以防水分丢失。记录脏器的绝对重量，并计算出相对重量（脏器系数=脏器重量/体重×100%）。

2.8 病理组织学检查

试验期间死亡的大鼠及试验结束后处死的大鼠，在剖检后取有关组织器官（心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、睾丸、卵巢）放入预冷的4 %多聚甲醛固定液内固定。按照石蜡切片常规制作程序制作组织切片，经苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察其病理组织学变化并采集图片。

2.9 统计分析

数据使用SPSS19.0 软件进行ANOVA 单因素方差分析，多个试验组与对照组的比较用LSD 法，组间比较用Duncan 法，结果用（±s）表示。

3 结果与分析

3.1 临床表现

整个试验期间，各剂量组大鼠体重持续增长。大鼠精神正常，饮水采食活跃，眼黏膜、行为活动正常，未见被毛有脱落，分泌物和排泄物无异常，未出现中毒症状以及其它的毒性反应，实验期间也没有出现受试动物因药物剂量而死亡的现象。

3.2 体重与摄食量比较

试验期间，大鼠的采食、饮水等行为活动正常，药物组与空白组比较饮水摄食量均无明显差异。各给药组与空白对照组大鼠体重变化比较差异不显著（P ＞0.05）。表明地龙口服液对大鼠的生长无影响（见表1）。

表1 亚慢性毒性试验中地龙口服液对大鼠体重的影响（±s，g）

表1 亚慢性毒性试验中地龙口服液对大鼠体重的影响（±s，g）

性别组别试验前第1周第2周第3周第4周雄空白对照组109.5±4.12159.75±11.9231.75±20.95261.5±26.59289±28.18低剂量组108.5±5160±5.03212±9.06252±11.94266.5±11.68中剂量组108±2.16153.25±6.7155±91.01242.25±17.17268.75±34.09高剂量组107±2.83154.75±6.08205.25±11.3255±9.52274.75±14.24雌空白对照组98.5±7.33134.75±10.08171.25±13.91197±16.81205.25±20.6低剂量组104.5±2.89141.25±5.44167.75±6.24199.75±7.27207.75±6.99中剂量组93.25±1.5105.75±62.13171.75±15.17199±18.89206.25±23.75高剂量组93.75±3.3131±2.16162±5.6186.25±9.46196±5.89

2.3 血液学指标比较

与对照组相比较，高剂量组嗜碱性细胞显著高于空白组，其他血液学指标各组差异均不显著(P＞0.05)。具体数据见表2。

表2 地龙口服液对大鼠血常规指标的影响（±s）

表2 地龙口服液对大鼠血常规指标的影响（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05。

指标空白组低剂量组中剂量组高剂量组白细胞（WBC，109/L）10.79±3.310.16±3.719.37±3.8212.28±6.64红细胞（RBC，1012/L）7.17±0.788.56±0.867.87±2.317.5±1.87血小板（PLT，109/L）888.43±622.9761.88±227.94824.11±307.06783.63±247.32淋巴细胞（LYM，109/L）7.17±1.337.14±2.36.66±2.597.63±3.56单核细胞（MID，109/L）0.49±0.20.39±0.140.37±0.160.5±0.32血红蛋白（HGB，g/L）176.71±17.09192.25±25.53180.56±55.41167.5±44.22嗜酸性粒细胞（EO，109/L）0.48±0.20.38±0.140.36±0.160.49±0.32嗜碱性粒细胞（BASO，109/L）0.01±00.01±00.01±0.010.02±0.01*中性粒细胞（GRA，109/L）0.49±0.20.39±0.140.37±0.160.5±0.32

2.4 血清生化比较

大鼠的各项生化指标对比空白组均差异不显著。可以认为地龙口服液对大鼠的较高剂量30 d喂养试验低毒或无毒（见表3）。

表3 地龙口服液对大鼠血清生化指标的影响（±s）

表3 地龙口服液对大鼠血清生化指标的影响（±s）

项目空白组低剂量组中剂量组高剂量组ALB（g/L）40.9±2.7241.5±3.4649.91±33.1331.72±6.01 ALT（U/L）33.99±7.3440.19±8.7737.99±9.7238.25±6.92 AST（U/L）51.32±9.8747.88±5.1748.85±5.1445.17±3.97 BUN（mmol/L）0.7±0.720.94±0.971.08±0.820.95±0.78 GLU（mmol/L）3.95±0.653.91±0.374.73±1.214.82±0.87 CRE（µmol/L）82.92±108.4291.58±66.4387.08±26.9362.49±17.19 CHO（mmol/L）2.61±0.282.68±0.682.91±0.512.55±0.34 TG（mmol/L）0.52±0.190.74±0.20.59±0.310.46±0.24 TP（g/L）40.9±2.7241.5±3.4649.91±33.1331.72±6.01

2.5 脏器系数比较

试验结束后剖杀各试验大鼠，高剂量组肝脏表面部分区域有较浅的黄斑，可能与脂肪变性有关；其他各脏器未见明显异常病变和损伤；与对照组相比，高剂量雄鼠的心脏系数升高；肝脏系数高剂量组雄鼠升高，所有给药组的雌鼠降低，其他各剂量组脏器系数均差异不显著(P ＞0.05)。结果见表4。

表4 地龙口服液对大鼠主要脏器系数的影响（±s）

表4 地龙口服液对大鼠主要脏器系数的影响（±s）

注：表示与对照组比较，*P ＜0.05，*P ＜0.01。

组别心（g/100 g）肝（g/100 g）脾（g/100 g）肺（g/100 g）肾（g/100 g）胃肠（g/100 g）卵巢/睾丸（g/100 g）雄空白组0.33±0.042.64±0.160.21±0.030.49±0.020.72±0.025.13±0.331.23±0.1低剂量组0.35±0.032.59±0.320.18±0.020.46±0.040.68±0.035.13±0.241.05±0.17中剂量组0.37±0.12.93±0.720.19±0.050.58±0.180.75±0.175.28±1.611.29±0.26高剂量组0.52±0.17*3.53±0.41*0.21±0.030.55±0.10.72±0.16.26±0.911.32±0.2空白组0.41±0.043.3±0.120.26±0.010.54±0.030.66±0.057.19±0.330.07±0.02低剂量组0.29±0.172.91±0.24*0.21±0.030.58±0.040.67±0.086.78±0.660.09±0.01中剂量组0.37±0.032.9±0.19**0.25±0.050.69±0.08*0.69±0.07*6.35±0.50.06±0.01高剂量组0.36±0.032.9±0.19**0.23±0.010.56±0.070.73±0.09**5.99±0.450.09±0.01雌

2.6 组织病理学比较

对第30 天采样的各剂量试验组和对照组大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃肠、睾丸、卵巢进行病理组织学检查。结果表明：高剂量组的心肌细胞间有轻微的淤血（见图1），肝索边缘的细胞部分发生脂肪变性和水泡变性，细胞肿胀变圆（见图2）。试验组的低、中、高剂量组大鼠肺泡壁有不同程度的增厚，肺泡上皮细胞增生，间隙增厚肺泡腔变窄，毛细血管有轻微的充血，腔内干净无渗出（见图3），肾小球毛细血管均发生了轻度的充血和溶血；低剂量组肾小管上皮细胞有轻微肿胀变圆，肾小管管腔变窄，间质部分区域发生了溶血（见图4）。各试验组与对照组其它脏器病理组织结构均正常。

图1 对照组（A）：大鼠心脏具有清晰完整的结构，心肌细胞呈条索状规则排列（HE 400 ×）；高剂量组（B）：心肌细胞间有轻微的淤血（HE 400 ×）

图2 对照组（A）：肝脏具有正常的肝小叶结构，在中央静脉周围肝细胞排列呈索状结构，中央静脉内有轻微的充血和溶血（HE 400 ×）；高剂量组（B）：肝索边缘的细胞部分发生脂肪变性和水泡变性，细胞肿胀变圆（HE 400 ×）

图3 对照组（A）：具有正常完整的肺泡结构，肺泡壁薄，由单层或多层细胞组成，肺泡腔内干净无异物（HE 400 ×）；高、中、低剂量组（B）：肺泡壁有不同程度的增厚，肺泡上皮细胞增生，间隙增厚肺泡腔变窄，毛细血管有轻微的充血，腔内干净无渗出（HE 400 ×）

图4 对照组（A）：具有正常的组织结构，皮质和髓质结构清晰完整（HE 400 ×）；高、中、低剂量组（B）：肾小球毛细血管均发生了轻度的充血和溶血，肾小管上皮细胞有轻微肿胀变圆，肾小管管腔变窄，间质部分区域发生了溶血（HE 400 ×）

3 讨论与结论

3.1 血常规检测

血常规检查是临床上最基础、最重要的化验检查之一，可作为临床诊治疾病的重要依据，判断外源化学物对机体的感染损伤[10～11]。本研究结果表明，地龙口服液30 d 亚慢性毒性试验的高剂量组嗜碱性粒细胞数量增加。通常情况下，嗜碱性粒细胞在血液中含量太低，略微的升高或降低一般不具有临床意义。且在本实验中，其他指标，如淋巴细胞、单核细胞、白细胞的差异均不显著，因此认为地龙口服液对大鼠血常规各指标无影响。表明地龙口服液对大鼠血液系统、骨髓造血功能无影响。

3.2 血液生化检测

血液学指标是反应机体健康状况的主要指标，也是疾病诊断和检测的指标之一。丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和尿素氮是反映肝、肾功能的主要指标[12]。血清中尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）的含量高低与肾功能密切相关，当肾脏受损时，可导致肾小球滤过能力下降，使BUN 和CRE 含量升高[13]。血糖、总胆固醇和甘油三酯作为重要的生化指标，3 个指标均与肝脏有关[14]。当肝脏发生炎症、坏死、中毒等损害及胆道疾病时，血糖、总胆固醇和甘油三酯将会出现变化[12]。亚慢性毒性实验结果表明，空白组与药物组的各项生化指标均无显著性差异，因此认为地龙口服液对大鼠的较高剂量30 d 喂养试验低毒或无毒。

3.3 病理组织学变化

对各剂量组大鼠内脏器官进行病理组织学观察结果显示：地龙口服液造成了肝脏和肾脏轻微淤血，高剂量组可能会导致肝细胞部分脂肪变性和水泡变性；药物组的肺泡壁均有不同程度地增厚，但是14 d 后再次观察，发现这些病理变化都能够得到恢复，表明这些损伤是可逆的，证明了地龙口服液的安全性。

4 结论

地龙口服液的高、中、低剂量组大鼠连续30 d灌胃给药后未出现明显的毒性反应。试验组大鼠采食、饮水和体重增长均正常。给药后30 d 所测得的大鼠血液学指标、血液生化指标与正常对照组比较，个别有一定的变化。各脏器组织病理学检查结果表明其可导致肝脏和肺脏发生可逆性的轻微变性变化，高剂量组可能会导致肝细胞的部分脂肪变性和水泡变性，无实质性变化。综上所述，对大鼠给予地龙口服液灌胃毒性小，长期服用安全，无明显的毒副作用，在3125 mg/kg 及其以下的剂量不会对动物机体产生明显的毒性反应。