规模化羊场致羔羊腹泻大肠杆菌的毒力基因检测及致病性试验

龙海宁，农绍锋，吴 静，谢芙蓉，刘 玉

（广西壮族自治区柳州种畜场，广西柳州 545003）

作为规模化羊场最为常见的一种疾病，羔羊腹泻发生的原因并不单一，极为复杂。其中大肠杆菌因素造成的羔羊腹泻十分普遍，若在此病发生后，未采取针对性措施予以治疗，就会严重威胁羊场，造成大量羔羊死亡。当前在对腹泻羔羊进行治疗的过程中，主要采取抗生素的方式，但近年来在各类抗生素的滥用下，临床耐药性不断升高，使得菌株对抗生素的敏感性较低。由于羊场地区的差异性，使得各地羔羊腹泻的病原菌流行也不一样，对于抗生素的耐药性也不同。鉴于此，需要在对羔羊腹泻之前，通过对致病菌的明确，制定科学的治疗方法，提升临床中对羔羊腹泻病症的治疗效果。

1 试验材料

1.1 试验菌株

全面掌握羊场羔羊饲养管理方式，探究羔羊圈舍存在的羔羊腹泻情况，了解羊场消毒程序，患病羔羊被毛十分暗淡，精神过于沉郁，粪便颜色多为褐色。对腹泻羔羊肛门处的粪便使用棉签进行少量蘸取并收集集中，随后将这些样品送入到实验室处理，在实施分离试验后共获得大肠杆菌55 株，并抽取了其中的十株开展毒力基因检测及致病性试验。

1.2 试验动物

由某学院实验室提供的试验小鼠体重为（25±2）g，随后开展相关试验。

1.3 主要试验试剂及仪器

主要试验试剂有麦氏比浊管、2×ma sterPCRMix、核酸染液GelvlewI、DL-2000DNAMarker以及细菌基因组DNA 提取试剂盒。

主要试验仪器有购自Bio-Rad 公司的H1650-W台式高速离心机、购自日本 sHIMADZU 的超净工作台、购自EPPendorf5453 的恒温振荡培养箱、购自尼康ECLIP sECi-L 的电泳仪、购自北京市六一仪器厂的GelDocXR+型凝胶成像系统、购自合肥美的电冰箱有限公司的-20℃冰箱、购自上海和泰仪器有限公司的电泳槽以及购自天根生物科技有限公司的细菌DNA 提取试剂盒。

1.4 RPCR 扩增引物的合成

引物序列由某生物科技公司合成，在本试验开展期间，共使用了fimC、FyuA、hiyF、eae 以及irP2 引物。

2 试验方法

2.1 株菌株DNA 提取

针对选出的十株样品开展试验，提取这些菌株中的DNA。

2.2 菌株大肠杆菌毒力基因试验

表1为PCR 反应体系详情，表2为不同毒力基因PCR 扩增反应条件详情。

表1 PCR 反应体系

表2 不同毒力基因PCR 扩增条件

2.3 RPCR 产物凝胶电泳

制备凝胶的制作：在三角瓶中加入1 g 琼脂糖，并加入100 ml 的缓冲液，通过电磁炉加热后使液体变清，并将5 μl 核酸染液加入到完全冷却的溶液，随后倒入制胶板，等待30 min 左右，拔出梳子。再将5 μl PCR 产物使用移液枪点入孔内，第一空加入5 μl 的DL2000marker，第二空对照不加样做阴性，剩下的样品产物再依次加入其余各孔，在电泳槽负极放入带孔的一端，盖好电泳槽，并接好电，在第四小格上有条带运动后马上切断电路，在成像仪内放置取出胶，针对试验结果进行详细观察，并拍照进行详细记录。

3 针对小白鼠实施致病性试验

在试验开展期间，主要对象为分离后随机选取的10 株菌株，在LB 液体培养基中接种选取的10株细菌纯培养物，基于37℃的摇床针对细菌实施全天培养，时间为24 h，并对菌液使用无菌生理盐水将其稀释至0.5 麦氏比浊仪中。

将55 只体重为（25±2）g 的小白鼠分为11组。每组共5 只小鼠，将1 ～10 组分为实验组，第11 组为对照组，每5 只小鼠接种一种株菌，作为对照组的第11 组则接种无菌生理盐水。实验组腹腔注射细菌溶液每只为0.3 ml，对照组腹腔注射无菌生理盐水每只为0.3 ml。给小鼠喂食24 h。观察其腹泻现象、精神情况以及被毛光泽程度。解剖实验小鼠，无菌取小鼠的心脏和肝脏，浸泡在一定量的无菌MacConkey 琼脂培养基中，在37℃培养过夜，观察细菌生长特性，为镜检奠定基础。

4 试验结果

4.1 毒力基因RPCR 检测结果

通过针对十株大肠杆菌实施eae、fimC、hlyF、fyuA、irP2 毒力基因测试后表明，不仅涵盖irP2 毒力基因，还在10 菌菌株中查到了其它毒力基因。10 株大肠杆菌除irP2 毒力基因外，在10 菌菌株中还分为检测到了其它毒力基因；10 株大肠杆菌中都具有eae 毒力基因，而69 号、74 号、76 号、77 号则具有菌株含毒力。具体数据见表3。

表3 毒力基因PCR 检测

4.2 小鼠致病性试验结果

大肠杆菌菌株64 号、69 号、70 号、71 号、73号、74 号、76 号和77 号均导致小鼠腹泻和死亡。2 组、3 组、5 组、7 组、9 组小鼠在12 h 内出现黑发、抑郁、腹泻等症状，24 h 内全部死亡；1 组和6 组小鼠在排便后12 h 内死亡。8 组和4 组在12 h内出现了3 只小鼠抑郁现象，2 只小鼠肛门内有少量粪便，但是未死亡。对照组小鼠生长良好，并未出现腹泻和死亡。腹泻死亡小鼠，会发现小肠明显病变，肠壁变薄，肝脏充血。采集实验组心脏和肝脏，接种于MacConkey 琼脂中，37℃培养12 h 后，得知该菌落基本等同于大肠杆菌的菌落。革兰氏染色阴性，两端可见短杆菌和钝圆。

5 讨论

5.1 研究结论

选择10 株菌株进行毒力基因检测。结果表明，通过进一步检测毒力基因，每5 个就有4 个毒力基因。4 株菌株携带3-4 个毒力基因，没有检测到irP2 基因。7 株菌株携带fyua 基因，阳性率为70%。9 株菌株携带FIMC 基因，阳性率为90%。肠出血性大肠杆菌携带EAE 和FIMC 毒力基因，在此期间检出率较高的莫过于EAE 和FIMC，以此证实分离菌株致病性较高。从相关文献中得知EAE 的阳性率为32.3%，可见在此病发生后，最关键的毒力因子就是EAE 基因。

本实验在致病性试验中选取了10 株携带毒力基因的大肠杆菌。将细菌溶液的浓度调整为0.5 米氏比浊管，并向每只小鼠腹腔注射0.3 ml。等24 h 后，观察到2 株没有引起小鼠腹泻和死亡，另外8 株则分别呈现了轻度或重度腹泻，均在随后死亡；肠壁变薄，肝脏部分充血。对死于腹泻的小鼠进行接种和分离。革兰氏染色显微镜检测致病性大肠杆菌。结果表明，分离的细菌致病性特征明显，可见在羔羊腹泻中致病性大肠杆菌占有比例极高，已成为导致羔羊腹泻的一种主要病原体。

5.2 规模化羊场羔羊腹泻的有效防治方法

5.2.1 建设良好养殖环境

养殖地的卫生状况和基础设施建设是影响羊羔产量和质量的重要方面。建设羊圈初期，羊圈的基础设备，比如草架、料槽、饮水槽等都应符合国家卫生标准。同时，要配置调节舍温的设备，为育羊提供一个相对稳定的温度环境，致力于冬暖夏凉羊圈的建设。

在日常管理中，养殖人员要做好养殖场的卫生清洁工作，定期对羊圈进行打扫，每周不低于2 次。大多数规模化养殖对羊群都会进行分类管理，通常用木栏杆将羊舍分为公羊圈、母羊圈、羔羊圈、肥羊圈等。工作人员在进行卫生打扫时，清洁用具应该区别使用，每个羊圈应该有一套清洁用具，避免羊群病菌的交叉感染。羊圈漏粪板需要清洁，清理掉堆积在漏粪板表面的羊粪减少恶臭。潮湿阴暗的环境往往会就增大羔羊患病的可能性，所以羊圈内要保持通风见阳，使其干燥舒适，利于羊群的活动。日常卫生管理工作越细致入微，腹泻病发病率会在一定程度上减少，如果羔羊患病了，其负面影响也会减弱。

5.2.2 关注母羊饲养和管理工作

在母羊育种的各个环节都需要设置一整套针对母羊饲养的具体方案，包括饮食搭配、活动区域等等，合理规划产羔母羊的饲养，对产出健壮的羊羔具有积极意义。养殖户要保证母羊饲料的充足，同时，母羊进食和活动环境也必须干净卫生，并定期对母羊圈进行消毒杀菌。饲养管理方面，需要开始抓膘保脂肪，饲喂优质的草料和饮用水。

产羔时的消毒工作最为关键，保证接产工具是经过严格的消毒。产后要检查母羊乳房的情况，保证羔羊饮用到的初乳的质量。产羔母羊的饲养关系着母羊的泌乳机能，母羊需要优质的饲料得到营养才能正常产奶，因此产后母羊体况的护理和恢复工作尤为重要。

5.2.3 合理安排工作环节

在大部分的养殖中，由于大量的市场需求，养殖场为了提供充足的供应，往往没有分批次，错时段进行羔羊养殖，而是将一大批母羊在同一时期采用发情技术，导致产羊期集中，初生羊羔数量大。然而如果饲养场的基础设施不完善，工作人员数量配给不足，在羔羊生长的各个环节不能完全注意到羊羔的生长状况，就极有可能导致患有传染病的羊羔不能及时隔离，羊羔群受到比较大范围传染，造成无法挽回的损失。所以养殖人员在产羔、育羔各个环节的工作安排中，都需要注重科学性，合理把控羔羊的生长和发育。

尤其是在断奶后，羔羊最容易出现应激反应的时期，饲养员更应该注重羔羊的饲喂。在母羊分娩后奶水不足的情况下，应该及时补给袋装鲜奶，将羊奶和鲜奶按照合适的比例混合，并且添加5g 活性酵母，减少羔羊因不是母乳而拒绝进食、适口性差以及腹泻等情况出现的可能性，帮助羔羊顺利过渡到完全进食羊饲料的阶段。

6 结论

通过相关试验数据结果可以看出，大肠杆菌具有致病性是引起该场羔羊腹泻的病原之一。养殖户需要结合规模化羊场养殖的实际情况，明确其腹泻原因，通过采取针对性、科学、有效的防治措施，才能有效预防羔羊腹泻现象，提升羊场的养殖效益。