LncRNA PCAT6通过靶向miR⁃185⁃5p对胰腺癌增殖、迁移和侵袭的影响

赵俞乔 刘浪 王健岗 关沧海 王东升 钟翔宇 姜兴明

哈尔滨医科大学附属第二医院普通外科（哈尔滨150086）

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，其全球发病率为4.2/105，我国发病率为3.6/105［1-2］。胰腺癌预后较差且多数胰腺癌患者得到诊断时已处于晚期，胰腺癌患者的5年生存率仅为9%［3-4］。虽然外科技术在不断细化和进步，胰腺癌的辅助治疗也取得了突破性的进展，但是胰腺癌患者的总体生存率仍不乐观［5-6］。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 个核苷酸的非编码RNA，其缺乏开放性阅读框而不具备明显的编码蛋白质的能力［7-8］。大量研究显示lncRNA 通过复杂的分子机制参与基因表达、RNA 转录和转录后调控等过程，异常表达的lncRNA 可以影响多种肿瘤的发生发展［9］。前列腺相关转录本6（prostate cancer asso⁃ciated transcript 6，PCAT6）于角质细胞中被首次发现［10］，现有研究证实PCAT6 在非小细胞肺癌、结直肠癌、骨肉瘤等中高表达，并且高表达的PCAT6 能够调控肿瘤细胞增殖、侵袭和转移［11-13］。目前，关于PCAT6 在胰腺癌中的表达及作用尚无相关研究报道。本研究旨在检测PCAT6 在胰腺癌中的表达情况，并通过实验观察PCAT6 对胰腺癌肿瘤细胞恶性生物学行为影响同时解析其作用机制，以期为胰腺癌寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本及细胞系67 例胰腺癌肿瘤组织样本及癌旁正常组织来源于哈尔滨医科大学附属第二医院行手术切除的患者（其中男39 例，女28例；＜60岁者36例，≥60岁者31例），同时取距离胰腺癌组织5 cm 以上的癌旁正常组织为对照。患者纳入标准：（1）病理学检查确认为胰腺癌；（2）术前未接受化疗或放疗；（3）自愿参加入组且无语言交流障碍；（4）无其他内科或外科合并症者。排除标准：（1）入院后有重大手术的患者；（2）认知功能障碍；（3）同时伴有其他器官的恶性肿瘤。样本离体30 min 内置于液氮速冻，后转入-80 ℃冰箱中保存。入组患者术前均签署知情同意书，并且本研究已经伦理委员会批准通过。人正常胰腺导管上皮细胞（normal human pancreatic duct epithelial cell，HPDE）和胰腺癌细胞系Capan⁃2、AsPC⁃1、PANC1、BxPC⁃3均购于美国ATCC公司。

1.1.2 试剂RPMI⁃1640 培养液、胎牛血清及细胞转染试剂Lipofectamine 3000 购自美国Invitrogen 公司；si⁃PCAT6 干扰序列和si⁃NC 阴性对照序列购自上海吉玛公司；RNA 抽提试剂TRIzol 购自美国Ambion 公司；Matrigel 基质胶购自美国BD 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Transwell 小室购自加拿大Costar 公司；紫外分光光度计NanoDrop 2000 购自美国Thermo 公司；逆转录试剂盒PrimeScript®RT Master Mix 购自中国宝日医公司；酶标仪microplate reader 购自瑞士Tecan 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取与qRT⁃PCR利用TRIzol 提取组织与细胞中的总RNA，紫外分光光度计检测总RNA表达水平；按试剂盒说明书行逆转录合成cDNA，扩增条件设置为95 ℃初始变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。PCAT6 上游引物序列：5′⁃CA⁃GGAACCCCCTCCTTACTC⁃3′，下游引物序列：5′⁃CTAGGGATGTGTCCGAAGGA⁃3′，GAPDH 上游引物序列：5′⁃GGGAGCCAAAAGGGTCAT⁃3′，下游引物序列：5′⁃GAGTCCTTCCACGATACCAA⁃3′，miR⁃185⁃5p 上游引物序列：5′⁃GGTGGAGAGAAAGGC⁃AGT⁃3′，下游引物序列：5′⁃TGCGTGTCGTGGAGTC⁃3′，U6 上游引物序列：5′⁃GCTTCGGCAGCACATAT⁃ACTAAAAT⁃3′，下游引物序列：5′⁃CGCTTCACGA⁃ATTTGCGTGTCAT⁃3′；采用2⁃ΔΔCt法计算相对表达量［14］。

1.2.2 细胞培养与转染Capan⁃2 和PANC1 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI⁃1640 培养液中，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。选取对数生长期细胞接种于培养板；待细胞密度达到50%左右，更换无血清培养基，按照Lipofectamine 3000 转染试剂说明书进行转染，将si⁃PCAT6 和Lipofectamine 3000 转染试剂加入实验组，并在对照组加入等量si⁃NC 和Lipofectamine 3000 转染试剂，si⁃PCAT6 序列：5′⁃AAACAUUCCAGGGCACCGAGAGAUG⁃3′。转染完成24 h 后进行后续实验。

1.2.3 CCK⁃8检测细胞增殖将Capan⁃2和PANC1细胞接种于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2条件下培养0、24、48 和72 h，随后加入10 μL CCK⁃8 溶液，在37 ℃、5% CO2条件下再培养4 h。在450 nm 波长处用酶标仪测定吸光度。

1.2.4 Transwell 实验检测细胞侵袭和迁移胰酶消化Capan⁃2 和PANC1 细胞后，用不含血清培养液重悬计数调整浓度，在Transwell小室中加入200 μL细胞悬液（约含5×104个细胞），小室下层充满10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2条件下再培养24 h，收集细胞膜，室温下用多聚甲醛固定15 min 后染色，高倍显微镜下拍照，并用Image J 软件计数。侵袭实验时需在Transwell 小室上层预先涂满Matrigel基质胶，其余步骤同迁移实验。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验利用双荧光素酶报告基因实验探究PCAT6 和miR⁃185⁃5p 之间的调控关系。将荧光素酶报告质粒、Renilla 荧光素酶报告pRL⁃CMV 质粒分别和miR⁃185⁃5p mimics 或miR⁃mimics NC 共转染Capan⁃2 和PANC1 细胞，48 h后收集细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明书进行荧光素酶活性检验。

1.2.6 统计学方法研究采用SPSS 23.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用Fisher 精确检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCAT6在胰腺癌组织和细胞中高表达qRT⁃PCR 检测结果显示，PCAT6 在67 例胰腺癌肿瘤组织中的表达量显著高于癌旁正常组织（P＜0.001；图1A）。临床病理资料相关性分析显示，PCAT6表达水平仅与TNM分级（P=0.010）密切相关，而与年龄、性别、肿瘤大小等因素无相关（表1）。此外，相较于HPDE 细胞，胰腺癌细胞（Capan⁃2、AsPC⁃1、PANC1、BxPC⁃3）中PCAT6 的表达水平明显提高（P＜0.001，图1B）。

注：A，PCAT6 在肿瘤组织中的表达高于正常组织；B，PCAT6在4 株胰腺癌细胞中的表达高于HPDE.*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001

2.2 下调PCAT6 表达抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移CCK⁃8 实验结果显示：与si⁃NC 组相比，si⁃PCAT6 转染后的Capan⁃2 和PANC1 细胞活性在48 h、72 h显著下降（P＜0.05，图2A），这一结果表明沉默PCAT6 能够显著抑制胰腺癌细胞的增殖。利用Transwell 实验进一步探究PCAT6 对于胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响，结果显示：转染si⁃PCAT6 的实验组细胞迁移数目明显少于对照组，同时在擦除基质胶后可观察到实验组细胞在Transwell 小室内层的侵袭数目减少（P＜0.05，图2B）。上述结果提示胰腺癌中高表达的PCAT6可以促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

表1 PCAT6 表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的相关性Tab.1 Association between the clinicopathological characteristics of PDAC patients and the PCAT6 expression例

2.3 PCAT6 在胰腺癌细胞中靶向调控miR⁃185⁃5p 的表达Starbase 数据库预测结果显示：miR⁃185⁃5p 可能是PCAT6 调控胰腺癌的潜在下游靶点（图3A）。利用qRT⁃PCR 检测发现miR⁃185⁃5p 在胰腺癌细胞中表达下调（P＜0.05，图3B）；转染si⁃PCAT6 后miR⁃185⁃5p 表达水平较于与si⁃NC 组显著升高（P＜0.05，图3C）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，PCAT6⁃WT+miR⁃185⁃5p mimics 共转染组的荧光素酶活性显著低于PCAT6⁃WT+miR⁃mimics NC 共转染组，而PCAT6⁃WUT+miR⁃185⁃5p mimics 共转染组的荧光素酶活性与PCAT6⁃WUT+miR⁃mimics NC 共转染组无明显差异（图3D）。以上结果提示，PCAT6 可以通过海绵吸附作用调控胰腺癌细胞中miR⁃185⁃5p 的表达。

图2 沉默PCAT6 对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响Fig.2 Effects of PCAT6 silencing on proliferation，migration and invasion of pancreatic carcinoma cells

3 讨论

随着研究的深入，有关lncRNA 在肿瘤中的作用不断被揭示，其对肿瘤的促进和抑制作用也为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路和途径［15-16］。胰腺癌是一种对放化疗敏感性不高且预后极差的恶性肿瘤，同时由于其发病隐匿，多数患者确诊时病情已发展至晚期［17-18］。有大量研究报道了lncRNA 在胰腺癌进展过程中发挥的重要调控作用：linc00511 在胰腺癌的发生发展中起了关键的调控作用；MALAT1可以作为竞争性内源RNA结合miR⁃217 进而调控kirsten 大鼠肉瘤的生长［19-20］。PCAT6 是一种新发现的在多种肿瘤中均能发挥调控作用的lncRNA，其在非小细胞肺癌、结直肠癌、骨肉瘤、肝细胞癌、宫颈癌、胆管癌和胃癌［21-23］等多种肿瘤中高表达并发挥促癌作用。但目前ln⁃cRNA PCAT6 在胰腺癌中的表达情况及调控作用尚未明确。

图3 LncRNA PCAT6 靶向调节miR⁃185⁃5pFig.3 The targeting regulation of miR⁃185⁃5p by the lncRNA PCAT6

本研究首先利用qRT⁃PCR 技术检测PCAT6 在胰腺癌组织和细胞中的表达，与相应的正常胰腺组织和细胞对比，PCAT6 的表达水平显著上升，并且高表达的PCAT6 与胰腺癌的TNM 分期和淋巴结侵袭密切相关。为进一步探究PCAT6 对胰腺癌的调控作用，利用si⁃PCAT6 和si⁃NC 分别转染Ca⁃pan⁃2 和PANC1 细胞，结果显示胰腺癌细胞增殖、侵袭和转移能力显著降低。此外，利用生物信息学数据库和双荧光素酶报告基因实验分析证实miR⁃185⁃5p 是PCAT6 的潜在下游靶点，qRT⁃PCR结果显示miR⁃185⁃5p 的表达水平与PCAT6 呈负相关。以上结果提示PCAT6 在胰腺癌中表达上调，通过海绵吸附作用调控miR⁃185⁃5p 的表达，进而发挥其促进胰腺癌增殖、侵袭和转移的作用。

综上所述，本实验证实PCAT6 在胰腺癌中高表达并与患者TNM 分期和淋巴结转移密切相关，并且可以通过靶向miR⁃185⁃5p 来调控抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。