甘草酸、桂皮酸干预类风湿关节炎的作用研究——基于MicroRNA22调控HIF-1α-MMP1/3通路

邹俊萍，王永萍，张 阳

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性免疫系统疾病，其病理组织学改变主要有滑膜组织增生、血管翳形成与关节软骨及骨组织结构的破坏[1]。本课题组前期研究[2]表明，甘草附子汤可以通过减少血清和滑膜组织中HIF-1α的含量，抑制炎症和新生血管形成，从而治疗RA。甘草酸、桂皮酸为甘草附子汤的活性成分，甘草酸类具有免疫调节、抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用[3-4]。桂皮酸能有效抑制多种癌症细胞的增殖并诱导细胞凋亡[5]。研究[6-8]发现，微小RNA22(MicroRNA22，miRNA22)、缺氧诱导因子1α( Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)与RA发病密切相关。故本实验用甘草酸、桂皮酸干预胶原诱导性关节炎( Collagen-induced arthritis，CIA)模型大鼠，观察这两种成分对CIA模型大鼠MicroRNA22、HIF-1ɑ、MMP1/3系统的影响，探讨甘草酸、桂皮酸通过影响MicroRNA22，调控HIF-1α-MMP1/3通路干预RA的机制。

1 材料与器材

1.1 试验药物

甘草酸(上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10668627，含量93%)；桂皮酸(江苏永健医药，批号：C10555085，含量99%)；雷公藤多苷片(远大医药黄石飞云制药有限公司，每片含10 mg，批号：国药准字Z42021212)。

1.2 动物

48只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量130～170 g，购于长沙天勤公司，大鼠合格证号：NO.1107261911000163。

1.3 试剂

牛ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂(美国 Sigma，批号：170306、SLBJ2840V)；HIF-1α/MMP1/MMP3一抗、二抗(美国 Affinity，批号：60h4847、47e7084、6542a14)；HIF-1α/MMP1/MMP3 ELISA试剂盒 (上海酶联生物科技有限公司，批号：12/2019)；RNA逆转录试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司，批号：AK4601)；引物mir22、U6(长度分别为：171 bp、190 bp，均由北京擎科生物科技有限公司合成)。

1.4 仪器

EG115OH包埋机、RM2265切片机(德国Leica)；XSZ-HS3显微镜(日本 OLYMPUS)；mμlISKANMK3酶标仪(美国Thermo)；实时荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 6)。

2 方法

2.1 造模与给药

将大鼠随机分成6组，每组8只。参考文献[9]的方法，先用 2 g/L牛Ⅱ型胶原溶液和不完全弗氏佐剂等体积乳化剂在除正常组外的其余5组大鼠右后足跖皮下注射0.4 mL/只，初步反应14 d后，左后足跖同法注射0.1 mL/只，加强反应 6 d，以此建立CIA大鼠模型。完成造模后，参考文献[3，10]选定给药剂量，甘草酸组予甘草酸100 mg·kg-1，桂皮酸组予桂皮酸8.68 mg·kg-1，甘草酸桂皮酸合用组予甘草酸100 mg·kg-1，桂皮酸8.68 mg·kg-1，雷公藤多苷组予雷公藤多苷10 mg·kg-1，模型组予2 mL生理盐水。连续灌胃20 d，1次/ d。

2.2 大鼠足爪图片和X射线影像

取材前拍取大鼠足爪图片和 X射线影像，评估CIA造模和药物对大鼠足爪病变的影响。

2.3 取材

大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)进行麻醉。待大鼠完全麻醉后，股动脉取血，静置1.5 h后离心(4 000 r/min，20 min)，取上清，-80 ℃保存。然后打开腹腔，取出脾脏，以纯水洗净，-80 ℃保存。剪开两侧膝关节皮肤，用刀片完整剥取膝盖髌韧带下淡黄色的滑膜组织，标记后放入包埋盒，10%多聚甲醛浸泡48 h。

2.4 血清HIF-1α、MMP1及MMP3含量检测

取大鼠血清，严格参照 HIF-1α/MMP1/MMP3 ELISA试剂盒说明，检测血清中HIF-1α、MMP1及MMP3的含量。

2.5 组织切片的制作与观察

取大鼠膝关节滑膜，常规石蜡包埋，5 μm切片。采用HE染色观察其形态学变化;采用免疫组化染色检测HIF-1α、MMP1及MMP3阳性表达。

2.6 RT-PCR法检测脾脏MicroRNA22表达

剪取100 mg脾脏，加1 mL Trizol用匀浆器研磨成浆，转至无RNase的1.5 mL EP管中，裂解10 min。加入200 μL氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温静置5 min。4 ℃，12 000 rpm，离心15 min，可见分成上(RNA)、中(蛋白)、下(DNA)三相。转移上层水相(约400 μL)于另一干净1.5 mL EP管中，加入400 μL异丙醇，混匀后室温静置10 min。4 ℃，12 000 rpm，离心10 min，管底可见白色的RNA沉淀。弃上清，加入无RNase的75%乙醇1 mL，涡旋混匀后，4 ℃，10 000 rpm，离心5 min，重复1次。弃上清，空气中干燥RNA沉淀5～10 min，将沉淀溶于20 μL DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μL用微量分光光度计测定OD260、OD280以及OD260/OD280值，计算RNA的纯度和浓度。依据OD260/OD280比值，估测RNA质量，比值在1.8～2.0符合实验要求。依据吸光光度值，按公式[总RNA浓度(μg/μL)=OD260×40×10-3]计算样品RNA的浓度。将总RNA放于-80 ℃冰箱内保存备用。各取已知纯度与浓度的RNA溶液5 μg，加入Oligo (dT) 18 (10 μmol/L)、dNTP (2.5 mmol/L)、5×Hiscript Buffer、Hiscript Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor，用ddH2O (Rnase free)配平至20 μL。加样后以反应条件：25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min、4 ℃ 10 min行RNA逆转录，将生成的cDNA做6倍稀释作为模板，在各基因中加入相应目的基因上下游引物及SYBR荧光染料，设置反应条件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 sec、60 ℃ 30 sec、40 cycles。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 大鼠足爪病变观察

造模后大鼠健康状态逐渐恶化，消瘦，脱毛，足爪肿、畸形、溶骨、新骨增生，在造模第20天上述症状表现最突出。药物干预后，足爪炎症反应减轻，尤其是甘草酸桂皮酸合用组、雷公藤多苷组减轻较明显，溶骨现象基本消退，桂皮酸组症状减轻不明显，关节畸形、溶骨仍然严重，并且可见明显成骨现象，见图1、图2。综上，类风湿关节炎动物模型建立成功，甘草酸和桂皮酸能抗炎消肿，且甘草酸桂皮酸合用组作用较为明显。

3.2 甘草酸、桂皮酸对RA大鼠膝关节滑膜组织形态学的影响

与正常组比较，模型组滑膜细胞结构受损，炎性细胞表达明显增加，血管翳增生。与模型组比较，各给药组滑膜组织炎性细胞浸润减少及血管翳增生被抑制，甘草酸桂皮酸合用组改善作用最强，见图3。综上，甘草酸、桂皮酸可缓解炎症反应与血管翳增生，甘草酸桂皮酸合用组作用明显。

3.3 甘草酸、桂皮酸对RA大鼠血清 HIF-1α、MMP1及MMP3含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3含量均明显升高。与模型组比较，各给药组HIF-1α、MMP1及MMP3含量均明显低于模型组。综上，甘草酸、桂皮酸能显著降低大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3含量，见表 2。

3.4 大黄素对RA大鼠膝关节滑膜组织HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表达显著升高。与模型组比较，各给药组HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表达均明显降低。上述3种蛋白表达均表现为甘草酸桂皮酸合用组下降最多，桂皮酸组下降最少，见表3及图4、图5、图6。综上，甘草酸、桂皮酸能显著抑制大鼠膝关节滑膜组织中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表达，甘草酸桂皮酸合用组时下调作用最强。

注：A.正常对照组；B.模型对照组；C.甘草酸组；D.桂皮酸组；E.甘草酸桂皮酸合用组；F.雷公藤多苷组。

注：A.正常对照；B.模型对照；C.甘草酸组；D.桂皮酸组；E.甘草酸桂皮酸合用组；F.雷公藤多苷组。

注：A.正常对照；B.模型对照；C.甘草酸组；D.桂皮酸组；E.甘草酸桂皮酸合用组；F.雷公藤多苷组。

表2 甘草酸、桂皮酸对RA大鼠血清中HIF-1α与MMP1/3表达的影响

注：A.正常对照组；B.模型对照组；C.甘草酸组；D.桂皮酸组；E.甘草酸桂皮酸合用组；F.雷公藤多苷组。滑膜组织免疫组化染色中棕黄色颗粒部分表示阳性表达。

注：A.正常对照组；B.模型对照组；C.甘草酸组；D.桂皮酸组；E.甘草酸桂皮酸合用组；F.雷公藤多苷组。

3.5 甘草酸、桂皮酸对RA大鼠脾脏MicroRNA22表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠脾脏中MicroRNA22基因表达明显降低。与模型组比较，各给药组MicroRNA22基因表达均明显升高，甘草酸组和甘草酸桂皮酸合用组MicroRNA22基因表达比正常组还显著上升。综上，各给药组各剂量均能显著上调RA大鼠脾脏中MicroRNA22表达，见表 4。

表4 甘草酸、桂皮酸对RA大鼠脾脏中MicroRNA22表达的影响

4 讨论

MicroRNA是广泛存在于真核生物细胞中的一类内源性、非编码的单链小分子 RNA[11]。MicroRNA通过引起靶mRNA降解、翻译抑制、脱腺苷酸化，调控多个上游基因表达及下游蛋白翻译，是细胞基因调控网络(Cellular gene regulatory network)中的重要组成部分，约90%的蛋白编码基因受MicroRNA的调控[12-13]。其中MicroRNA-22是由22个核苷酸组成的非编码蛋白RNA，在细胞发育、造血过程、器官形成、细胞增殖、凋亡及肿瘤发生等过程中均发挥重要作用[14]。HIF-1α是体内细胞应答缺氧应激的关键因子[15]。研究[16]表明，HIF-1α在RA患者的受累关节中过度表达是RA的重要靶点，本课题组前期实验亦发现，RA大鼠中HIF-1α的表达是增强的。在RA发病过程中，大量关节软骨的破坏是关键性的临床症状。而这种破坏是由滑膜中，高活性的基质金属蛋白酶(MMPs)所介导。MMPs具有降解细胞外基质的作用，其中，MMP-1负责降解细胞外基质的主要组成成分Ⅰ型胶原蛋白，而MMP-3的作用则更广泛，其与关节的炎症及损坏密切相关[17]。有研究[18]表明，在缺氧条件下MMP-3的表达完全受HIF-1α调控，而 MMP-1表达也部分受其调控。RA中滑膜衬里层增生、滑膜细胞增生、炎症细胞浸润及无功能血管形成，造成受累关节滑膜缺氧。此时，MicroRNA22通过减少表达来激活靶基因：翻译HIF-1α的mRNA，使HIF-1α分泌增多。MMP-3 /MMP-1表达量受HIF-1α调控上升，促进软骨降解及骨破坏，最终导致RA病情发展[18，19-21]。

实验结果显示，造模后大鼠逐渐出现倦怠、跛行、腹泻、脱毛、厌食、消瘦等亚健康体征。双后足爪逐渐出现软组织红肿、关节畸形、骨基质破坏及后期新骨增生等现象，于造模第20天上述症状表现最严重。用甘草酸、桂皮酸干预，大鼠体质量下降幅度变小，腹泻缓解，其中，甘草酸桂皮酸合用组效果比甘草酸组、桂皮酸组更佳。与模型组比较，甘草酸桂皮酸合用组大鼠足爪软组织红肿、关节畸形及溶骨现象基本消退。甘草酸组大鼠足爪软组织红肿、关节畸形明显好转，但溶骨与成骨现象仍然明显。桂皮酸组关节畸形、溶骨及成骨现象严重。滑膜组织HE染色结果显示，正常组大鼠膝关节滑膜组织形态正常，结构清晰。而模型组滑膜细胞结构损伤，炎性细胞表达显著上升，血管翳增生。连续灌胃甘草酸、桂皮酸20 d后，滑膜组织炎性细胞浸润减少，血管翳增生被抑制，甘草酸桂皮酸合用组大鼠病变减轻较明显。以上实验结果表明，本实验类风湿关节炎大鼠模型建立成功，甘草酸、桂皮酸具有抗炎消肿、抑制新生血管形成、保护骨与软骨的作用，甘草酸、桂皮酸协同作用，对RA的治疗效果更佳。滑膜组织免疫组化染色检测结果显示，与正常组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表达均显著增加；与模型组比较，各给药组HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表达均明显下调。大鼠血清检测结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3水平均明显增加；与模型组比较，各给药组HIF-1α、MMP1及MMP3表达均明显降低。而脾脏RT-PCR检测结果显示，与正常组比较，模型组大鼠脾脏中MicroRNA22基因表达水平明显降低；甘草酸、桂皮酸干预20 d天后，与模型组比较，MicroRNA22基因表达水平均明显上升，甘草酸组、甘草酸桂皮酸合用组还高于正常组水平。

由此，可推测甘草酸、桂皮酸对RA的作用机制可能是通过抑制MicroRNA22，调控HIF-1α-MMP1/3信号通路中相关分子生成，从而控制炎性发展，降低骨与软骨组织损伤，减少新生血管生成。