重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移与侵袭作用及机制研究

何 昊，刘 杨，钱小英，靳曼菲，郑 蕾*，成 昭

重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移与侵袭作用及机制研究

何 昊1，刘 杨2，钱小英1，靳曼菲1，郑 蕾1*，成 昭1

1. 西安医学院药学院，陕西 西安 710021 2. 空军军医大学 药学系，陕西 西安 710032

研究重楼皂苷Ⅶ对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移与侵袭作用及机制。采用MTT法检测重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞存活率的影响；观察重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞形态的影响；采用划痕实验和Transwell小室法考察重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞迁移和侵袭能力的影响；采用流式细胞术检测重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响；采用Western blotting法检测重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、DNA酶抑制物（inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease，ICAD）和程序性死亡分子配体-1（programmed death ligand 1，PD-L1）蛋白表达的影响。重楼皂苷Ⅶ可抑制PANC-1细胞存活率，显著抑制PANC-1细胞迁移和侵袭能力（＜0.01），显著诱导PANC-1细胞凋亡（＜0.05、0.01），显著升高PANC-1细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、PARP、Bax表达水平（＜0.01），显著降低pro-PARP、ICAD、Bcl-2、PD-L1蛋白表达水平（＜0.05、0.01）。重楼皂苷Ⅶ能够抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭，并可能通过下调PD-L1表达诱导PANC-1细胞凋亡。

重楼皂苷Ⅶ；胰腺癌PANC-1细胞；增殖；凋亡；程序性死亡分子配体-1

胰腺癌发病率位居肿瘤第10位，死亡率位居第4位，患者的5年生存率仅有9%[1]。2017年我国新增约8.36万胰腺癌新发病例和8.51万死亡病例[2]。胰腺癌恶性程度高、侵袭转移能力强，且由于胰腺的解剖位置较深，早期临床症状隐匿不易诊断，超过85%患者初次诊断时癌细胞已经出现局部浸润或转移，预后效果不佳[3]。手术结合化疗是目前胰腺癌临床治疗的主要手段，但由于胰腺癌细胞的特性，传统化疗药物极易出现耐药性，因此，抗胰腺癌的新药开发迫在眉睫。中药及其活性成分具有良好的抗肿瘤作用。重楼为百合科植物云南重楼Smith var．(Franch.) Hand- Mazz.或七叶一枝花Smith var.(Franch.) Hara的干燥根茎，主要分布于云南、四川、陕西等地，性微寒、味苦[4]。七叶一枝花为秦巴山区特色太白七药之一，为清热解毒类中药，用于治疗痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等。现代药理学研究表明，甾体皂苷为重楼中发挥主要药效作用的成分，其苷元主要为薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元2类，重楼皂苷Ⅶ为具有偏诺皂苷元的皂苷类化合物，具有良好的抗肿瘤活性[5-6]。本研究考察了重楼皂苷Ⅶ对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移及侵袭的影响，为重楼皂苷用于抗肿瘤治疗提供基础。

1 材料

1.1 细胞

PANC-1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 药品与试剂

重楼皂苷Ⅶ（质量分数≥98%，批号76296‑75‑8）购自成都普菲德生物技术有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉素混合液购自美国HyClone公司；四甲基偶氮唑蓝噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；Hoechst 33258染料购自美国MedChemExpress公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（批号20180406）购自上海七海复泰生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司；程序性死亡分子配体-1（programmed death ligand 1，PD-L1）蛋白抗体（批号00071664）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（批号00027610）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗体（批号00022011）、DNA酶抑制物（inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease，ICAD）抗体（批号00021351）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号00045121）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）抗体（批号00039510）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10004129）购自美国Proteintech公司；羊抗鼠二抗（批号115‑035‑003）购自美国Jackson ImmunoResearch Laboratories。

1.3 仪器

3111型CO2培养箱、Multiskan GO自动全波长酶标仪、MicroPure超纯水机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；IX73倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；CJ-2S104超净工作台（天津泰斯特仪器有限公司）；AX224ZH分析电子天平（美国OHAUS公司）；Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）；ChemiDoc XRS＋化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

PANC-1细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2.2 重楼皂苷Ⅶ母液的配制

重楼皂苷Ⅶ溶于DMSO配制成100 mmol/L母液，分装保存于−20 ℃冰箱。临用时用DMEM高糖培养基稀释至不同浓度。

2.3 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞存活率的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以1×105/mL接种于96孔板中，100 μL/孔，于培养箱中培养24 h。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 μmol/L）组，弃去培养基，给药组分别加入100 μL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h后，弃去培养基，PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），于37 ℃孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，采用酶标仪测定490 nm处的吸光度（），计算细胞存活率。

2.4 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞形态的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以1.5×105/mL接种于6孔板中，2 mL/孔，于培养箱中培养24 h。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）组，弃去培养基，给药组分别加入2 mL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h后，弃去培养基，PBS缓冲液洗涤2次，加入2 mL 70%冰乙醇固定30 min，PBS缓冲液洗涤，加入2 mL Hoechst 33258染液（5 μg/mL），避光染色15 min，PBS缓冲液洗涤，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.5 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞迁移和侵袭的影响

2.5.1 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞水平迁移能力的影响 取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以1.5×105/mL接种于6孔板中，2 mL/孔，待细胞贴壁后，弃去培养基。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）组，给药组分别加入2 mL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，于培养箱中培养，分别于0、12、24、48 h在倒置显微镜下观察并拍照。

2.5.2 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞垂直迁移能力的影响 Transwell小室置于24孔板中，取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以2×105/mL接种于Transwell小室中。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）组，给药组Transwell小室下室分别加入600 μL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液（重楼皂苷Ⅶ母液以20%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释），对照组加入不含药物的培养基，于培养箱中培养24 h。弃去Transwell小室中培养基，PBS缓冲液洗涤，甲醇固定20 min，0.1%结晶紫溶液染色3 min，PBS缓冲液洗涤，用棉签擦去小室内细胞，于显微镜下观察细胞。

2.5.3 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞侵袭能力的影响 Transwell小室置于24孔板中，按照1∶3将Matrigel胶用预冷的无血清培养基稀释，40 μL/孔，均匀铺于Transwell小室底部，于培养箱中孵育5 h，弃去小室内残余液体。取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以4×105/mL接种于Transwell小室中。后续操作同“2.5.2”项步骤。

2.6 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，以1.5×105/mL接种于6孔板中，2 mL/孔，于培养箱中培养24 h。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）组，弃去培养基，给药组分别加入2 mL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h后，弃去培养基，收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书染色，采用流式细胞仪进样分析。

2.7 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1蛋白表达的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，以1.5×105/mL接种于T25培养瓶中，培养24 h，弃去培养基。设置对照组、重楼皂苷Ⅶ（1 μmol/L）组，给药组加入2 mL重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，分别培养0、12、24、48 h，收集细胞，按照RIPA裂解液说明书提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，加入上样缓冲液于100 ℃加热变性。蛋白样品经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，洗涤后分别加入Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1抗体，4 ℃孵育过夜，洗涤后加入羊抗鼠二抗，于室温孵育2 h，洗涤后加入ECL发光液，采用化学发光成像系统曝光。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞存活率的影响

如图1所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组细胞存活率降低，呈剂量相关性，重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞的半抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）值为（1.27±0.18）μmol/L，因此选择0.5、1.0、2.0 μmol/L重楼皂苷Ⅶ进行后续研究。

图1 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞存活率的影响()

3.2 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞形态的影响

如图2所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组细胞形态发生变化，出现颗粒状凋亡小体，镜下可见核浓缩和核碎裂。

3.3 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞迁移和侵袭的影响

如图3所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组PANC-1细胞迁移率显著降低（＜0.01），且呈剂量和时间相关性；如图4所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组从小室上层透过聚碳酸酯膜进入下室的细胞数显著减少（＜0.01），呈剂量相关性，表明重楼皂苷Ⅶ可抑制PANC-1细胞的迁移和侵袭能力。

3.4 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响

如图5、表1所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ（0.5 μmol/L）组中末期凋亡细胞比例显著升高（＜0.01），重楼皂苷Ⅶ（1.0、2.0 μmol/L）组早期凋亡细胞和中末期凋亡细胞比例均显著升高（＜0.05、0.01）表明重楼皂苷Ⅶ可诱导PANC-1细胞凋亡。

3.5 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1蛋白表达的影响

如图6所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组Cleaved Caspase-3、PARP、Bax蛋白表达水平均显著升高（＜0.01），pro-PARP、ICAD、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低（＜0.05、0.01），且呈时间相关性，表明重楼皂苷Ⅶ可促进PANC-1细胞凋亡。如图7所示，重楼皂苷Ⅶ组PD-L1蛋白表达水平显著降低（＜0.01），呈时间相关性，表明重楼皂苷Ⅶ诱导PANC-1细胞死亡可能与下调PD-L1表达相关。

图2 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞形态的影响 (×200)

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下图同

图4 重楼皂苷VII对PANC-1细胞垂直迁移 (A、C) 及侵袭(B、D) 的影响()

图5 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响

表1 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响()

与对照组比较：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group

图6 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞中凋亡相关蛋白表达的影响()

图7 重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞中PD-L1蛋白表达的影响()

4 讨论

胰腺癌侵袭性强，早期易转移，患者生存率较低。天然产物是抗肿瘤药物研发的重点来源[6]，从中药中寻找具有抗胰腺癌作用的活性成分具有重要意义。重楼皂苷Ⅶ为中药重楼中的主要活性成分，课题组前期研究发现重楼皂苷Ⅶ具有较好的抗肿瘤作用，能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭，并可通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路诱导肿瘤细胞凋亡[7]。本研究结果显示，重楼皂苷Ⅶ可抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭，诱导PANC-1细胞凋亡。

PD-1/PD-L1是一对免疫共刺激因子，PD-1表达于T细胞表面和初级B细胞表面，PD-L1作为其配体，在肿瘤细胞及浸润的淋巴细胞均有表达。正常情况下，PD-1通过PD-L1发挥免疫调控作用，PD-1/PD-L1通路的激活可减少免疫反应对正常组织的损伤，避免自身免疫疾病[8-9]。PD-1/PD-L1还可参与肿瘤免疫逃逸，其激活可降低肿瘤局部微环境T细胞的免疫效应，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤，促进肿瘤发生；阻断PD-1/PD-L1通路可逆转肿瘤免疫微环境，增强内源性抗肿瘤免疫效应[10]。肿瘤细胞能够通过上调PD-L1表达来逃避T细胞识别，从而逃避免疫杀伤[8,11]。本研究结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ可显著上调PANC-1细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、PARP、Bax表达水平，显著降低pro-PARP、ICAD、Bcl-2、PD-L1蛋白表达水平，表明重楼皂苷Ⅶ可诱导PANC-1细胞凋亡。

综上所述，重楼皂苷Ⅶ能够抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭，诱导其凋亡，同时可能通过下调PD-L1蛋白表达参与免疫调节。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effect and mechanism of polyphyllin VII on proliferation, migration and invasion of pancreatic cancer PANC-1 cells

HE Hao1, LIU Yang2, QIAN Xiao-ying1, JIN Man-fei1, ZHENG Lei1, CHENG Zhao1

1. School of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China 2. School of Pharmacy, Air Force Medical University, Xi’an 710032, China

To study the effect and mechanism of polyphyllin Ⅶ on proliferation, migration and invasion of human pancreatic cancer PANC-1 cells.MTT assay was used to detect the effect of polyphyllin Ⅶ on viability of PANC-1 cells. Effect of polyphyllin Ⅶ on morphology of PANC-1 cells was observed. Effect of polyphyllin Ⅶ on cell migration and invasion were detected by wound scratch assay and Transwell chamber. Effect of polyphyllin Ⅶ on apoptosis was detected by flow cytometry. Western blotting was used to detect the effect of polyphyllin Ⅶ on expressions of cysteine protease-3 (Caspase-3), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-associated X protein (Bax), poly ADP-ribose polymerase (PARP), inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease (ICAD), and programmed death ligand 1 (PD-L1) in PANC-1 cells.Survival rate of PANC-1 cells was inhibited, migration and invasion of PANC-1 cells were significantly inhibited (< 0.01), cell apoptosis was significantly induced (< 0.05, 0.01), expressions of apoptosis-related proteins Cleaved Caspase-3, PARP, Bax were significantly increased (< 0.01), and expressions of pro-PARP, ICAD, Bcl-2, and PD-L1 were significantly reduced by polyphyllin Ⅶ(< 0.05, 0.01).Polyphyllin Ⅶcan inhibit proliferation, migration and invasion of PANC-1 cells, and may induce PANC-1 cell apoptosis by down-regulating PD-L1 expression.

polyphyllin Ⅶ; PANC-1 cells; proliferation; apoptosis; programmed death ligand 1

R285.5

A

0253 - 2670(2021)07 - 1981 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.015

2020-11-10

国家自然科学基金青年项目（81603265）；陕西省创新人才推进计划-青年科技新星项目（2019KJXX-057）；陕西省高校青年杰出人才支持计划（05041904）；陕西省科技厅面上项目（2021JM-489）；国家级大学生创新训练项目（201911840017）

何 昊（1985—），副教授，博士，从事中药抗肿瘤及免疫研究。Tel: (029)86177545 E-mail: hehao313@163.com

郑 蕾，副教授，博士。Tel: (029)86177548 E-mail: zhengleixa@163.com

[责任编辑 李亚楠]