电化学分析法快速测定紫小麦中的烷基间苯二酚

杨新童 闫 苍 李书国

(河北科技大学，石家庄 050018)

近年来，随着人们对全谷物功能性活性物质研究的进展，发现其中一些功能性与酚类化合物密切相关。美国食品药品管理局(FDA)将全谷食品定义为所含全谷物质量比超过51%的食品。流行病学调查和科学实验均表明，全谷食品能有效地预防心血管疾病和直肠癌、乳腺癌等某些癌症，并对肥胖、糖尿病等多种慢性疾病具有预防作用。其中，以烷基间苯二酚最具有代表性[1]。烷基间苯二酚是首次在小麦、黑麦等麦类中发现的一类特殊的酚类类脂。主要存在于谷物中，其中小麦、黑麦中含量较多，干燥麦粒中其含量大约为0.015%～0.3%，但大麦中含量相对较少[2,3]。研究发现，谷物中烷基间苯二酚具有抑菌[4,5]、抑制肿瘤[6-8]、抗氧化[9-11]及抑制多种酶活性[12-14]等多种生理功能。此外，烷基间苯二酚可作为全谷物食品的生物标志物。通过检测人体尿液或血浆中的烷基间苯二酚及其代谢物，可以有效预测全谷物食品的摄入情况[15-17]。同时也可以判断全谷物制品品质(如：全麦粉)，为广大消费者提供食品质量保障。因此，烷基间苯二酚在食品加工中的应用、相关保健食品的研发以及生理、药理方面作用极具开发潜质。由此可见，开发一种快速分析方法对全谷物制品企业及医学研究等极为重要。

目前，国内外常用于分析检测烷基间苯二酚的方法主要有薄层色谱分析法(TLC)、比色法[18]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[19]、紫外分光光度法[20]。以上几种方法所需操作时间较长，成本较高，而电化学分析方法可以大大缩短检测时间，其所用试剂较少，节约成本，且该方法操作简捷，灵敏度相对较高，可以实现快速高效得出检测结果，具有广阔的开发应用潜力。

本实验基于烷基间苯二酚在玻碳电极上的氧化还原特征，从而建立一种快速有效检测烷基间苯二酚的电化学分析方法，并有效应用于食品、医学等领域中。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

5-十七烷基间苯二酚标准品(纯度98%以上，CAS：41442-57-3，分子量：348.562 5)；甲醇、无水乙醇；固蓝RR盐；碳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、柠檬酸(所用试剂均为分析纯)； 紫小麦。

1.2 仪器与设备

LK98BⅡ型微机电化学分析系统，三电极系统(工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极)，KQ 2200型超声波清洗仪，GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱，TGL-10B高速台式离心机，UV-5500PC紫外可见分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 电极预处理

玻碳电极在使用前用0.05 μm的Al2O3粉抛光至镜面，用去离子水清洗后，再分别用HNO3∶H2O=1∶1、乙醇、去离子水分别进行超声处理1 min，然后利用快速循环伏安法在1 mol/L H2SO4溶液中扫描(电位：-0.5～0.8 V 扫描速率：50 mV/s)至稳定，对玻碳电极进行活化，用N2吹干后备用。

1.3.2 电解质及标准溶液的配制

配制1/15 mol/L Na2HPO4溶液和1/15 mol/L KH2PO4溶液，并根据2种溶液配比调节pH值至9，得到电解质溶液；将5 mg烷基间苯二酚标准品以甲醇作溶剂定容于50 mL容量瓶中，得到2.87×10-4mol/L标准溶液，在0～4 ℃避光密封保存备用。

1.3.3 检测样品的处理

取10 g粉碎后的紫小麦，以料液比1∶5的甲醇在100 W功率下超声20 min，3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液并抽滤得到清澈提取液，在0～4 ℃避光密封保存备用。

1.3.4 电化学方法测定

利用快速循环伏安法在0.0～1.0 V之间以50 mV/s速度扫描，研究其电化学特征；利用微分脉冲伏安法优化检测条件并考察峰电流值与烷基间苯二酚浓度之间的关系，其电参数：初始电位0.0 V，终止电位1.0 V，脉冲间隔0.3 s，电位增量0.008 V。电解质溶液：1/15 mol/L Na2HPO4溶液和1/15 mol/L KH2PO4溶液(pH值为9)。

1.3.5 标准曲线及样品测定

将1.3.2配制的标准溶液分别配制浓度为0、2.5、5、10、15、20、50 μmol/L(与电解质溶液混合后浓度)，并根据上述微分脉冲伏安法分别测定，记录其电化学响应电流值，每个浓度做3组平行实验，取其平均值作为测定结果，绘制标准曲线。以上述微分脉冲伏安法测定1.3.3样品，并根据标准曲线计算样品中烷基间苯二酚的含量。

1.3.6 紫外分光光度法测定[20]

固蓝RR盐储备液的配制：以1%的乙酸的甲醇溶液为溶剂，准确配制质量分数为0.05%的固蓝RR盐储备液(4 ℃可以保存7 d)。

工作液的配制：将储备液与甲醇按比例1∶4(体积比)混合，制成固蓝RR盐工作液(现用现配)。

将1.3.2配制的标准溶液分别用甲醇配制浓度为5.738、2.869、1.435、0.717、0.359 μmol/L。取2 mL稀释后的标准溶液与4 mL固蓝RR盐工作液混合，并用质量分数为5%的K2CO3溶液将溶液调至碱性，在波长为480 nm处测定吸光度，以甲醇为空白对照。重复3次实验取平均值，绘制标准曲线。以该紫外分光光度法测定样品中的烷基间苯二酚，并根据标准曲线计算1.3.3样品中烷基间苯二酚的含量。

根据紫外分光光光度法得到标准曲线：

y=0.051 52x-0.000 125R2=0.996 45

式中：y为吸光度值；x为对应烷基间苯二酚浓度/μmol/L。

1.4 数据处理

本实验数据均取3组平行实验测定值的平均值作为测定结果，运用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析，应用单因素方差分析进行显著性差异分析(P<0.05，差异显著)，并运用Origin8.6绘制数据图。

2 结果与讨论

2.1 烷基间苯二酚在玻碳电极上的电化学行为

循环伏安图显示了烷基间苯二酚在玻碳电极上的电化学行为。如图1所示，玻碳电极在空白溶液中无峰出现，表明该电极自身和空白底液中不存在具有电化学活性的物质。在图1中0.52 V处有一个显著的氧化峰，反向扫描无还原峰出现，说明烷基间苯二酚在玻碳电极表面被氧化，发生明显的电催化作用，且反应不可逆。这是由于芳香环上的羟基易被氧化，从而使其具有电化学活性，反应不可逆可能是由于酚类物质在电氧化过程中形成了某些非电化学活性物质，从而影响可逆反应发生。增大烷基间苯二酚浓度，峰电流也随之增大。

注：a为Na2HPO4-KH2PO4空白溶液；烷基间苯二酚浓度b为2.61×10-5 mol/L，c为3.92×10-5 mol/L。图1 烷基间苯二酚在玻碳电极上的循环伏安图

2.2 检测条件的优化

2.2.1 电解质溶液的选择

根据烷基间苯二酚的理化性质，考察了几种常见电解质溶液，并利用循环伏安法记录了烷基间苯二酚在磷酸缓冲溶液和0.1 mol/L高氯酸锂的乙腈溶液中的电化学行为。结果发现，在有机电解质及磷酸盐缓冲溶液电解质中烷基间苯二酚均出现氧化峰，无还原峰，且在0.1 mol/L高氯酸锂的乙腈溶液中，烷基间苯二酚的氧化峰电位相对靠后，峰电流较小，而在磷酸盐缓冲溶液中氧化峰电流比在有机电解质更大，峰形更好。因此，烷基间苯二酚在磷酸盐溶液中更易发生氧化反应，而烷基间苯二酚本身几乎不溶于水，溶于一些有机溶剂。甲醇极性较大，甚至对于一些盐溶液都具有一些溶解能力。因此，选择甲醇作溶剂，可以作为烷基间苯二酚与电解质溶液之间的一种介质，来增加烷基间苯二酚在磷酸盐溶液中的溶解度，从而达到检测目的。当待测样品与盐溶液配比小于1∶1时，混合溶液呈澄清状态，有机溶剂对实验结果无明显影响可以采用该方法检测，反之会有部分盐析出，对实验结果造成一定的影响。本实验采用有机混合溶液(甲醇与待测样品混合)与电解质溶液配比为1∶3进行实验。

注：a为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾溶液；b为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液；c为磷酸氢二钠-柠檬酸溶液(pH均为7)。图2 不同电解质对烷基间苯二酚的微分脉冲伏安曲线的影响

由图2可知，在相同pH的不同电解质溶液中，烷基间苯二酚的电化学行为相似，但峰电位、峰电流不同。图2(a)的峰形最佳，为减小误差，增大灵敏度，故选择Na2HPO4-KH2PO4作为电解质溶液。

2.2.2 pH的影响

利用微分脉冲伏安法研究了pH对烷基间苯二酚的峰电流的影响。由图3可知，pH对氧化峰电流及氧化峰电位影响较大。当pH9时峰电流达到最高值，随着pH的降低，烷基间苯二酚的氧化峰电位不断正移，且氧化峰电流不断减小，同时峰电位(Ep)与pH具有较好的线性关系，线性回归方程为Ep=1.195-0.078pH，R2=0.991。这表明该电氧化过程有质子的参与，是一个质子电子转移的过程。由于该磷酸盐缓冲溶液pH最大为9.18，故选择pH9的Na2HPO4-KH2PO4作为电解质溶液。

图3 pH值对烷基间苯二酚的峰电流的影响

2.2.3 脉冲间隔和电位增量的影响

图4、图5研究了2.61×10-5mol/L的烷基间苯二酚在不同脉冲间隔和不同电位增量下的影响。如图4、5所示，脉冲间隔与电位增量对峰电位几乎无影响，但对峰电流及峰形影响较大。从图4可以看出，随着脉冲时间的缩短，峰电流不断增大，峰宽也随之改变，峰逐渐变宽；图5中显示，电位增量增大，峰电流逐渐增大，峰形逐渐变宽。为得到较好峰形，从而减小误差，综合考虑以上因素，选择电参数条件：电位增量0.008 V，脉冲间隔0.3 s。

注：a-d表示脉冲间隔分别为0.3、0.5、1.0、1.2 s。图4 脉冲间隔对烷基间苯二酚氧化峰电流的影响

注：a-d的电位增量分别为0.002、0.004、0.006、0.008 V。图5 电位增量对烷基间苯二酚氧化峰电流的影响

2.3 标准曲线

图6为在最佳测定条件下利用微分脉冲伏安法分别测定了0、2.5、5、10、15、20、50 μmol/L时对应的曲线。由此可知，峰电流(Ip)随烷基间苯二酚浓度的增加而增加，并在2.5～50 μmol/L范围内，烷基间苯二酚浓度与Ip呈现良好的线性关系，线性方程为Ip=0.576 0+0.067 6C(Ip单位μA，C单位μmol/L)相关系数R2=0.999 7，最低检测限为5.78×10-7mol/L(RSN=3)。

注：a-g表示烷基间苯二酚浓度依次为0、2.5、5、10、15、20、50 μmol/L。图6 不同浓度烷基间苯二酚的微分脉冲伏安曲线图

2.4 抗干扰性和稳定性、重复性

在pH为9的Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，固定烷基间苯二酚浓度为2.61×10-5mol/L溶液进行抗干扰实验，考察了小麦中常见的几种离子和化合物。结果表明，100倍浓度的Na+、K+、Ca2+、Cl-、SO42-对其峰电流相应值的影响均在3%以下；5倍浓度的谷氨酸在烷基间苯二酚扫描范围内无峰出现，并对其峰电流响应值的影响仅为1.5%； 5倍浓度的抗坏血酸、生育酚、芦丁均在电位为0.3 V之前有氧化峰，但对烷基间苯二酚峰电流影响均在3.5%以下，且峰电位无明显变化。综上所述，该电化学传感器的抗干扰性较好。

采用微分脉冲伏安法对2.61×10-5mol/L的烷基间苯二酚进行重复性实验，重复测定10次，其氧化峰电流响应值相对标准偏差(RSD)为1.3%，表明该电化学传感器具有较好的重复性。

分别配制3组(每组2个平行实验)不同浓度的烷基间苯二酚标准溶液，并利用微分脉冲伏安法测定。结果显示，3组的氧化峰响应电流值的变化均在2.9%以下，说明该电化学传感器具有较好的稳定性。

2.5 紫小麦样品中烷基间苯二酚的测定

将按1.3.3方法处理后的样品提取液，分别采用电化学方法和紫外分光光度法检测样品中烷基间苯二酚的含量，并进行加标回收实验，计算其平均值和相对标准偏差。结果如表1所示，本方法回收率在99.5%～102.0%之间，紫外分光光度法回收率在91.9%～94.2%。结果表明两者检测结果基本一致。另外，本方法的相对标准偏差较紫外分光光度方法小，表明本方法测定结果更加稳定。

表1 紫小麦样品中烷基间苯二酚加标回收率测定结果

3 结论

本研究基于烷基间苯二酚在玻碳电极上的氧化还原特征，建立了一种特异性强、且快速灵敏的电化学传感器。采用微分脉冲伏安法和快速循环伏安法对烷基间苯二酚在玻碳电极上的电化学行为进行分析并对其检测条件进行了优化。根据其循环伏安图显示，烷基间苯二酚在0.52 V处发生不可逆氧化反应；利用微分脉冲伏安法对检测条件进行优化，根据其自身性质探究电解质溶液及电参数的选择，最终确定最佳检测条件为pH9的Na2HPO4-KH2PO4溶液作为电解质溶液，电位增量0.008 V，脉冲间隔0.3 s；确定了烷基间苯二酚在玻碳电极上的氧化电流与其浓度之间的线性关系，同时该方法具有检测限低(5.78×10-7mol/L)，灵敏度高，抗干扰性强且重现性和稳定性好等优点。