不同储藏年限稻谷真菌群落多样性与优势菌属探究

葛志文 周建新 方 勇 王光宇 邱伟芬

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210023)

稻谷是我国三大主粮之一，在生产、消费与安全储藏方面一直备受关注[1,2]。安徽省是我国稻谷主产地之一，属于典型的湿润区，高温高湿气候增加了储藏稻谷霉变的风险。此外，稻谷在收获和运输过程中，与土壤、空气、水等自然物质和机械接触，携带大量的微生物进入储藏期[3-5]。储藏过程中适宜的温湿度环境，有利的促进了真菌的生长繁殖与代谢[6,7]。产毒真菌的存在易导致大量真菌毒素产生，不仅破坏稻谷安全与品质，甚至威胁消费者健康，引发致癌、致畸、致突变等病理反应[8]。

目前关于储藏稻谷真菌区系的研究，主要采用传统平板菌落计数法和直接计数法[9]。然而，只有可培养真菌才能在培养基中生长，但它们仅占真菌总数的1%左右[10,11]，不能完全反映真菌区系分布。Illumina MiSeq测序法由于能对不同环境[12]中的真菌群落进行全面的检测，包括可培养与不可培养真菌，如植物根际[13,14]，土壤[15,16]，深海沉积物等[17,18]，因此，近年来在多个领域研究中得到广泛应用。

本研究先后对新入库、储藏1年、储藏2年及储藏3年的稻谷样品进行了采集，采用Illumina MiSeq测序法，对储藏稻谷样品进行了DNA总序列测定，进一步全面深入了解不同储藏年限稻谷样品真菌群落多样性及优势菌属分布，以期为有效采取稻谷储藏霉变防控措施，创新防控技术提供更充分的理论依据，确保储藏稻谷的安全与品质。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

从安徽省国属粮库中采集样品。稻谷在(20±5) ℃和50%±5%相对温湿度条件下储藏，含水量低于12%。先后对新入库、储藏1年、2年以及3年的稻谷样品通过三层五点法进行采集，每个样品重复采集三次，共得12个样本。新入库、储藏1年、储藏2年及储藏3年稻谷样品分别编号为S0-1，S0-2，S0-3；S1-1，S1-2，S1-3；S2-1，S2-2，S2-3；S3-1，S3-2，S3-3。

1.1.2 试剂

真菌基因组DNA试剂盒、Miseq v3试剂盒、AgencourtAMPure XP核酸纯化磁珠、TransStart®Top Taq DNA Polymerase kit、dNTP mix。

1.2 实验仪器

Eppendorf 5810R离心机，WH-2微型旋涡混合仪，AB 2720 Thermal Cycler，Invitrogen qubit3.0分光光度计，安捷伦2100 生物分析仪，Nanodrop 2000检测仪，光照测序仪，ABI 2720型热循环器。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取和PCR扩增

DNA提取步骤按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书完成，将提取的总DNA加入到50 μL缓冲液中，-80 ℃储存备用。扩增真菌ITS 1区所选用的引物为：ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。每个样本扩增三次，以标准真菌基因组DNA混合物作为阳性对照。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，循环25 次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。将所得PCR产物在Illumina MiSeq台式测序机上运行。

1.3.2 操作分类单位聚类和物种注释

对下机原始序列数据进行质量过滤，以获得高质量序列[19]。通过UPARSE软件将具有97%以上相似性的序列分配给相同的可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。每个OTU选择对应的代表序列，进行物种注释。

1.3.3 多样性和统计分析

以OTU数量，Chao 1指数，ACE指数，Shannon指数，Simpson指数和覆盖度为指标，分析各样品的α多样性。参照Ramette[20]的方法，通过主成分分析比较样品间β多样性，根据样本OTU绘制各分类水平物种丰度图及热图。

1.4 数据处理与分析

数据均采用 Excel 2016 和 Origin 8.5 数据统计软件进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 测序数据优化及统计

对原始下机数据进行质量控制，扩增子测序共产生2 071 941个序列数，序列平均长度为242.49 bp，统计有效数据见表1。S0稻谷样品有效序列数最大，其优化序列数占比也最高，达98.46%；S1稻谷样品的序列数次之，S2稻谷样品的序列数最少，优化序列数占比分别为98.38%、97.38%；S3稻谷样品的序列数较S2稻谷样品序列数略有增加，优化序列数占比为97.83%。S2序列数与S0、S1、S3序列数差异显著(P<0.05)，表明储藏期真菌群落数量在储藏期逐渐减少后又有所增加。

表1 不同储藏年限稻谷样品DNA扩增序列统计

根据物种生物学理论，将稻谷样品中微生物种类分为界、门、纲、目、科、属、种六个等级，如表2，每列表示样品在对应分类学水平上的OTU个数。结果发现，在每个分类学水平上，S0稻谷真菌群落中微生物种类对应最多，而S3稻谷真菌群落中微生物种类数最少，整体顺序为S0>S2>S1>S3，且S0与S2，S1与S3之间差异不显著，表明储藏过程中真菌群落物种数发生变化，与储藏年限不成正相关，随储藏年限增加群落物种数趋向减少。

表2 不同储藏年限稻谷样品物种注释统计分析

2.2 储藏稻谷真菌群落丰富度和多样性指数分析

Shannon-Wiener曲线用于反映测序数据量的合理性及样品中物种的丰富程度，如图1所示，以抽取的序列数及其对应的多样性指数构建曲线，以反映各样本在不同测序数量时真菌群落物种多样性。曲线已趋向平坦，说明测序数据量已接近饱和，可以反映样本中绝大多数的微生物信息[21]。

图1 四种不同储藏稻谷以97%同源性OTU聚类的Shannon-Wiener曲线

表3中比较了12个储藏稻谷样品的样本序列在文库中的覆盖度，最低为0.997 7，最高达到0.998 8，表明测序结果能表达样品的完整多样性。Chao1、ACE反映了不同年限储藏稻谷样品真菌群落的物种丰富度差异，比较知S0稻谷真菌群落的Chao1和ACE值均最大，表明其真菌群落物种丰富度最大，S3稻谷真菌群落物种丰富度最小。Shannon指数越大，表明真菌群落的物种多样性越大，Simpson指数则与之相反。S0稻谷真菌群落的Shannon多样性指数值为3.29，Simpson指数值为0.079。稻谷储藏1年后，其真菌群落物种多样性有所下降，达3.17，储藏期延长，其真菌群落种类先增加后减少。S2稻谷真菌群落Shannon多样性指数最大，平均值达3.38，对应的Simpson指数最小，为0.067。在储藏3年后，真菌群落物种多样性大大降低，Shannon多样性数值仅为2.08。正如前人研究[22]，稻谷新入库时携带大量田间真菌，微生物群落种类丰富，在进入储藏期后，田间真菌逐渐被储藏真菌替代，储藏真菌逐渐增加。但因储藏条件的控制，储藏真菌生长受到抑制，随储藏年限的增加而不断减少[23，24]。

表3 储藏稻谷真菌群落多样性指数统计分析

2.3 储藏稻谷真菌群落组成与多样性分析

根据测序结果及物种注释结果，在属和种水平上对物种结构进行统计分析并构建对应的丰度谱。按生物分类学，4种储藏稻谷真菌群落可分为5个门、24个纲、69个目、132个科、232个属，336个种。

由图2可知，不同储藏年限稻谷样品的菌属结构及相对丰度比各有不同。S0稻谷样品中假丝酵母菌属(Candida)，内生菌属(Hypocreales)，盘蛇孢属(Ophiosphaerella)和帚枝霉属(Sarocladium)是优势菌属，相对丰度为19.83%、14.33%、11.90%和3.24%。S1稻谷样品中曲霉属，帚枝霉属，内生菌属和盘蛇孢属为优势菌属，相对丰度为12.70%、7.42%、7.09%和3.69%。S2稻谷样品中内生菌属，曲霉属，盘蛇孢属，帚枝霉属和节担菌属(Wallemia)为优势菌属，其相对丰度为14.91%、11.30%、8.28%、8.00%和5.84%。S3稻谷样品中内生菌属，节担菌属，盘蛇孢属和曲霉属为优势菌属，其相对丰度为57.43%、8.55%、6.41%和3.98%。由此可知，稻谷储藏期不同，优势菌属不同，进入储藏期后曲霉属一直为优势菌属之一。曲霉菌属在新入库时含量相对较少，进入储藏期时，随着储藏时间的延长有相应的增加，随后又呈现逐渐下降的趋势。

图2 不同储藏年限稻谷的真菌相对丰度(属水平)

不同储藏年限稻谷样品的菌种组成及相对丰度比也各有不同。从图3知，S0稻谷样品中物种种类数最多，主要菌种是肉座菌(Hypocrealessp)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，格孢(Ophiosphaerellaagrostidis)和中型假丝酵母(Candidaintermedia)，其相对丰度占比为14.33%、12.03%、11.90%和7.58%。S1稻谷样品中主要菌种分别是稻帚枝霉(Sarocladiumoryzae)，肉座菌，帚状曲霉(Aspergilluspenicillioides)和格孢，其相对丰度占比为7.29%、7.09%、5.01%和3.69%。S2稻谷样品中主要菌种分别是肉座菌，格孢，稻帚枝霉和帚状曲霉，其相对丰度占比为14.91%、8.28%、7.82%和7.77%。S3稻谷样品中物种种类数最少，主要菌种分别是肉座菌，格孢，稻帚枝霉和帚状曲霉，其相对丰度占比为57.43%、6.41%、2.71%和1.79%。此外，结果发现培养基易生长菌株黄曲霉(Aspergillusflavus)，交链孢霉(Alternariasp)依然是储藏稻谷真菌群落中优势菌株，由此可见，稻谷在入库后不同储藏期间均有曲霉和链格孢霉存在，这与平板培养法结果相一致[25]。培养基不易生长菌株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)，多育曲霉(Aspergillusproliferans)也被检测出来，相较于传统的平板菌落计数法，更加广泛全面的反映了储藏稻谷真菌群落的菌种组成。

图3 不同储藏年限稻谷的真菌相对丰度(种水平)

选择相对丰度排行前25的物种进行制图，并对4组样本菌属种类进行了聚类分析。由图4可知，随储藏年限增加，主要菌属假丝酵母菌属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、帚枝霉属(Sarocladium)、链格孢属(Alternaria)、枝孢霉属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)的相对丰度呈现不同变化。储藏年限越长，储藏稻谷中假丝酵母菌属和链格孢属的相对丰度增加，曲霉属、帚枝霉属、枝孢霉属和青霉属的相对丰度先增加后减少，表明稻谷在储藏中其真菌群落结构发生变化，优势菌群发生了明显的演替，有研究者表明这与储藏过程中稻谷的生理代谢产物积累，不同类型微生物代谢产物形成相互抑制有关[26，27]。

图4 不同储藏年限稻谷样品属水平热图分析

2.4 不同储藏年限稻谷真菌群落间差异分析

Venn图用于统计多个样品中所共有和独有的OTU数目，从而直观的表现环境样品的OTU数目组成相似性及重叠情况。

如图5所示，S0、S1、S2、S3稻谷样品真菌群落总OTU数分别为657、518、551、451。对比发现，S0稻谷具有的特性OTU数量最多，达222个，随着储藏年限增加，S1、S2、S3储藏稻谷样品真菌群落中具有的特性OTU数量逐渐减少，依次为117、113和75个。四种稻谷样品真菌群落中共有的OTU数相对较多，达217个。由此可见，不同储藏年限稻谷真菌群落存在很多相同物种和不同物种，群落间物种丰富度存在差异，且新入库储藏稻谷真菌群落物种丰富度远大于储藏期的稻谷样品。

注：不同样本分组用不同的颜色表示，不同颜色圆圈重叠的区域标注数字表示共有的OTU数。图5 不同储藏年限稻谷样品OTU分布比较Venn图

如图6所示，基于不同储藏年限稻谷样品获得的OTU丰度表进行主成分分析，以比较分析粮库控温储藏环境下储藏稻谷真菌群落间差异。第1、2主成分分别占总变异的70.242%和19.891%。由图可知，不同储藏年限稻谷样品位置间均相对分散，其中S3稻谷样品位置与其他储藏年限稻谷样品位置的相对分散最远，表明其菌群物种多样性与其他储藏年限的稻谷样品差异显著，说明储藏时间以及储藏条件对稻谷真菌群落物种多样性的变化有显著影响。

图6 不同储藏年限稻谷样品主成分分析图

3 结论

随储藏年限增加，稻谷真菌群落多样性发生变化，优势菌属也发生演替，优势菌属假丝酵母菌属(Gibberella)和链格孢属(Alternaria)的相对丰度增加，曲霉属(Aspergillus)、帚枝霉属 (Sarocladium)、 枝孢霉属(Cladosporium)和青霉属(Penicillium)的相对丰度先增加后减少，其均是储藏稻谷中产真菌毒素高风险因子，应作为稻谷储藏过程中的重点防控对象。

新入库储藏稻谷真菌群落物种丰富度远大于储藏期的稻谷样品。各生物分类学水平上，新入库稻谷真菌群落中微生物种类对应最多，且真菌群落多样性与其他储藏年限稻谷差异显著(P<0.05)，储藏3年稻谷真菌群落中微生物种类数最少。目前储藏稻谷真菌群落中无法确认分类学信息的真菌在属级占比达30.37%，种级占比达37.81%，后续实验将对储藏稻谷真菌群落中未知真菌种类鉴定、群落中菌属特征及功能特性等展开进一步研究。