酿酒酵母铬离子抗性及富集作用初步研究

周建琴 祝宗英 孙婉悦 蔡佳鑫 才卓玛 江苏食品药品职业技术学院药学院

一、前言

（一）铬的生物化学功能

许多研究表明，铬的生物化学功能主要是作为胰岛素的加强剂作用。Schwarz 和Mertz[1]首先观察到铬在糖代谢中的作用。从啤酒酵母中分离的生物活性铬制剂和合成的生物活性铬配合物，两者都能降低糖尿病小鼠的血浆葡萄糖和甘油三酯[2]。

（二）富铬酵母的研究意义

无机铬形式不利于人体吸收，而有机铬则能促进对铬的吸收。富铬酵母是最普遍的一种补铬形式。制备富铬酵母的常用酵母菌种是啤酒酵母（又称酿酒酵母）[3]。啤酒酵母是一种安全可靠、它是不需要做毒性试验即可直接食用的少数几种菌种之一；啤酒酵母是发酵工艺成熟，生产周期短，便于生产控制；啤酒酵母是目前作为微量元素载体最优势的菌种；此外，啤酒酵母还富含其它人体所必须的营养素，用它来制备富铬酵母，除具有补给铬的功效外，还兼具补给氨基酸等营养物质的作用。因此，选用啤酒酵母作为铬的补给载体意义显著。富铬酵母一般是通过在酵母培养基中加入无机铬盐（如KCr（SO4）2）的方法来制备的[4]：酵母在高浓度铬环境中吸收并同化无机铬化合物，之后转化为有机铬富集在酵母细胞中。

本研究涉及抗铬离子较强的酵母菌株的筛选，以此为出发菌经活化，抗性筛选扩大培养，分析了在不同铬浓度，培养时间，对铬富集的影响以及抗铬菌株最佳吸收条件及有机铬含量和分布，为制备富铬酵母和利用工业化废酵母治理铬污染奠定了基础。

二、材料

（一）试剂

酵母提取物，葡萄糖，蛋白胨，麦芽，浓HNO3，HClO4，KCr（SO4）2。

（二）培养基

（1）YEPD 培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，加蒸馏水至1L，加入20 克琼脂，pH6.0，115℃湿热灭菌15min，冷藏备用。

（2）麦芽汁培养基：取适量干麦芽，将其磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴锅中糖化3～4h，糖化程度用碘法判断之。将糖化液用4～6 层纱布过滤，滤液搅拌煮沸后再过滤。将滤液稀释到5～6 波美度，pH 约6.4，加入2%琼脂，115℃湿热灭菌15min。

（三）主要仪器及设备

电子天平，单人双面净化工作台，DNH-D 冷冻恒温振荡器皿，5804 离心机，血球记数板，研钵，显微镜，TAS-986 原子吸收分光光度计。

（四）酵母菌株

本实验中所用的10 株啤酒酵母株来源由江苏食品药品学院研究院和啤酒车间提供。

三、方法

（一）KCr（SO4）2 母液配制

称取50 克KCr（SO4）2水溶后，移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，121℃灭菌15min，常温下保存待用。

（二）铬离子抗性酵母的筛选

（1）菌株的复苏，活化

①将菌株原种接5ml 试管斜面活化一次（3 支，28℃，36-48h）

②从三支试管中选出一支生长良好的接种至5ml 麦汁试管活化第二次（3 支，28℃48h）

③从三支麦汁试管中选出一支生长良好的平板划线（3 支，28℃，72h）

④挑选形态较好的单菌落，接种5ml 液体YEPD 培养基，震荡培养36h，作为涂布平板的种子酵母

（2）不同种酵母耐金属铬筛选

制备铬离子浓度分别为0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15 mg/ml，0.2 mg/ml，0.25mg/ml 的固体培养基50ml，待冷却到50℃用微量可调移液器吸取100μl 麦芽汁培养基，滴入50ml 锥形瓶中，摇匀，浇注平板，28℃恒温培养，48h 后观察不同来源酵母菌株的培养情况，从中筛选铬离子抗性较好的酵母菌株。

（3）铬离子抗性菌株的驯化

将筛选到的抗性酵母菌株接入5ml 含铬0.25mg/ml 的YEPD 液体培养基的锥形瓶中，放入恒温调节摇瓶柜中驯化培养，温度28℃，36h，浇注铬离子浓度分别为0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15 mg/ml，0.20 mg/ml，0.25mg/ml 的平板，筛选抗性克隆。

（三）酵母的扩大培养

活化后挑选生长健壮、饱满的单细胞菌落3～4 个分别接到试管斜面上培养（优选3～4 个斜面，28℃培养48h）；选择一个生长良好的斜面接种到25 支麦芽汁试管中进行28℃培养36～48h，生长到细胞浓度为1×107个/ml，按10%的接种量分别接入含KCr（SO4）2量 为0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15mg/ml，0.20 mg/ml，0.25mg/ml 的 麦 汁 培 养 基500ml 三角瓶5 到6 只，28℃震荡培养96h。

表1 培养后铬含量的分布状况

（四）酵母细胞数的测定

在生长到第12h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h 取样，测定酵母的细胞数。无菌条件下各吸取1ml 发酵液，滴20μl 于细胞记数板上，在显微镜下统计细胞数，每样做5 次，取平均数M。然后根据公式：细胞浓度=M*50（个/ml）获得发酵液中的细胞浓度。

（五）干酵母粉的制备

将发酵结束后的发酵液分装到50 ml 的离心管，5000rmp 离心10 分钟，收集沉淀，用100ml 蒸馏水5000rmp 离心10 分钟，重复洗涤3 次。将酵母细胞沉淀放置在烘箱内105℃，热风烘干7-8 小时，称重后在密闭玻璃瓶内保存备用。

（六）发酵液中和酵母粉中铬含量的测定

将发酵结束后的发酵液分装到50 ml 的离心管，5000rmp 离心10min，取1mL 上清液测定其中的铬含量。

称取1g 酵母粉用研钵研碎，100mL 烧杯中，加入20 mL 浓HNO3，10mLHClO4，在烧杯上盖一个表面皿，在恒温电板上加热至120℃加热1 小时，升温到180℃加热2小时，在加热到200℃至冒白烟，消化液呈无色透明即可，冷却，将消化液转移至100或250mL 容量瓶中，并用蒸馏水多次洗涤烧杯，定容至刻度，即为富铬酵母粉样品溶液，原子吸收光谱法测定其中的铬含量[5]。

四、结果

（一）不同来源酵母菌株对铬离子抗性结果

不同来源酵母菌株在不同的铬离子浓度的平板上培养，结果：铬离子浓度在0.05mg/ml 和0.10umg/ml 时，10 株菌株都能生长，单菌落生长饱满，且形态比较明显。在铬浓度为0.15mg/ml 时，除淮药11 和食品2B，其余8 株受到铬的抑制作用，菌体不能生长。而铬浓度为0.20mg/ml 时，除食品2B 能生长外，其余9 株都不能生长，当铬浓度为0.25mg/ml 时，10 株酵母菌株都不能正常生长，结果说明酵母菌株食品2B 具有较好的抗铬离子能力，因此我们选食品2B 为出发菌，继续研究。

（二）菌种驯化条件对酵母产量及富铬能力的影响

将经驯化的上2B 与未驯化的上2B 克隆分别接种培养，比较它们的酵母产量和富铬的量，结果表明驯化后酵母产量为0.63g/500ml，未驯化的酵母产量为0.53g/500ml，增加不明显，但是铬离子的富集量明显增加，未驯化的铬富集量为158.1 ug/ml增加，驯化后增加为238.5 ug/ml。

（三）培养时间和不同铬离子浓度对酵母生长的影响

将筛选到的酵母菌株上2B 铬离子抗性克隆分别接种到浓度为0.20mg/ml 和0.25mg/ml 铬离子的培养基中扩大培养，跟踪检测酵母细胞数。结果表明发酵液中的酵母细胞数目随着培养时间的延长逐渐增加，培养48h 后，发酵液中酵母细胞数由于絮凝作用急剧减少。酵母细胞数随发酵时间的增长而急剧增加，到48h 时达到为7×107个细胞/mL。当铬浓度达到0.25mg/ml 浓度时，酵母细胞数增长明显缓慢，到48h 时达到最高，约为4.0×107个细胞/mL，表明较高浓度的铬离子对酵母细胞的生长具有抑制作用。

（四）干酵母产量测定

将发酵结束后的发酵液离心，取酵母，洗涤、干燥，称取干酵母的重量，结果：随着培养基中铬浓度的增加，由于铬的抑制作用而酵母干重会有所下降。在铬浓度为0.05mg/mL 时，每500mL 培养基中干酵母重最大，为1.25g。铬浓度为0.10mg/mL时，酵母干重为1.02g，随着铬离子浓度的增加，酵母干重减小但是在浓度0.10mg/mL到0.20mg/mL 之间减小幅度不大，当铬离子浓度为0.25mg/ml 时，酵母干重小至0.41g，表明铬离子浓度增加到一定浓度时会导致干酵母得率的下降很快。故综合考虑铬离子浓度对酵母的抗性和富集情况选择培养酵母时添加铬离子合适浓度为0.20mg/mL。

（五）发酵液中铬的富集情况

分别对发酵液上清液，干酵母处理液以及酵母洗涤液样品中的三价铬离子进行原子吸收光谱分析，结果如表1 所示。

从表1 中可以看出三价铬的分布状况，培养基中的铬一部分存留在发酵上清液中，一部分被菌株酵母所吸收，转化为有机铬。另外一部分由于絮凝作用，离心后存在于沉淀物中。酵母细胞对铬离子的吸收量随培养基中铬离子浓度的增加而增加，但是并是成比例，表明酵母细胞对重金属离子的刺激具有缓冲作用，多数铬离子随着酵母的絮凝而沉淀，沉淀量随铬离子浓度增加而增加。

五、讨论

我们通过铬离子抗性的筛选，得到一株对铬离子抗性较好的酵母菌株，并通过一系列的实验得出了酵母细胞数，干酵母重，以及铬在培养基，发酵上清液，酵母细胞等中的含量分布，最后通过原子吸收光谱对铬离子进行分析，结果表明培养基中的铬离子最终会因酵母的吸收和酵母的絮凝而减少。各项实验的结果酵母对铬离子的最大吸收量为0.24mg/g，絮凝对铬离子的最大沉淀量为0.26mg/g。这些数据为开发富铬酵母的健康应用和处理环境中铬污染问题提供了重要的科学依据。