柴贝止痫汤在大鼠体内主要入血成分及其药代动力学研究

董笑克 刘金民 李中浩 袁斯远 王凯悦 黎莉莉 郑香春

中国有900万以上癫痫患者，约30%因抗痫药物难以控制发作而成为耐药性癫痫。单一靶点的药物很容易产生耐药，对耐药性癫痫的治疗难以发挥应有的疗效。柴贝止痫汤是刘金民教授在《医学心悟》定痫丸及《伤寒论》柴胡加龙骨牡蛎汤的基础上，结合王永炎院士及个人多年临证经验所创制，由柴胡、天麻、浙贝母、法半夏、石菖蒲、牡蛎和地龙7味药组成，具有疏肝理气、化痰息风、醒神开窍的功效。团队通过大量临床及基础研究发现柴贝止痫汤具有良好的抗痫疗效及安全性，具有较高的临床价值及研究意义[1-8]。为了进一步挖掘其抗痫作用物质基础，本研究通过借助超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)-串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)技术以及气相色谱(gas chromatography，GC)- MS/MS技术，分析柴贝止痫汤主要吸收入血成分，并借助DAS软件计算其药代动力学参数，为中药治疗耐药性癫痫有效成分的挖掘开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 药物及试剂

柴贝止痫汤由柴胡12 g、天麻15 g、浙贝母9 g、法半夏9 g、石菖蒲9 g、煅牡蛎30 g、地龙6 g组成，购自北京中医药大学东方医院药剂科，每剂中药统一煎至100 mL。

贝母素甲(110750)、贝母素乙(110751)、贝母辛(111892)、柴胡皂苷A(110777)、柴胡皂苷D(110778)、天麻素(110807)、香草醛(100093)、原儿茶醛(110810)、胡芦巴碱(110883)、α-细辛醚(100298)、β-细辛醚(112018)、普萘洛尔(100783)标准品购自中国食品药品检定研究院，柴胡皂苷C(B20149)、对羟基苯甲醛(B20327)、天麻苷元(对羟基苯甲醇，111970)、柠檬醛(B25317)、茴香脑(B20579)、细辛醛(B21345)、甲苯磺丁脲(B26427)标准品购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器

DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪；Thermo Q EXACTIVE质谱仪；气相色谱-质谱联用仪(GC-MS/MS)，液相部分：岛津GC-2010 Plus，进样器：AOC-5000 Plus，质谱部分：MS/MS；色谱柱：RTX-5MS(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；控制软件与数据处理系统为岛津公司高效化学工作站(GC-MS/MS Real Time Analysis)。

1.3 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠6只，体重(200±10)g，由北京维通利华实验技术有限公司提供，合格证号：SYXK(京)2011-0024。动物饲养于北京中医药大学东方医院动物实验中心，饲养级别为SPF级，3只/笼，保证正常光照节律、温湿适度、环境安静，正常大鼠生长繁殖饲料饲养，自由进食和饮水。

1.4 柴贝止痫汤有效成分收集

柴贝止痫汤由柴胡、天麻、浙贝母、法半夏、石菖蒲、牡蛎和地龙7味药组成，通过检索相关文献和筛选药物中含量较大、研究较多、对癫痫治疗可能存在主要作用的化学成分，锁定目标成分17种，分别为：贝母素甲(verticine，来源：浙贝母)、贝母素乙(verticinone，来源：浙贝母)、贝母辛(贝母辛碱，peimisine，来源：浙贝母)、柴胡皂苷A(saikosaponin A，来源：柴胡)、柴胡皂苷D(saikosaponin D，来源：柴胡)、柴胡皂苷C(saikosaponin C，来源：柴胡)、对羟基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde，来源：天麻)、天麻苷元(对羟基苯甲醇，p-hydroxybenzoic alcohol，来源：天麻)、天麻素(gastrodin，来源：天麻)、香草醛(vanillin，来源：天麻)、原儿茶醛(protocatechualdehyde，来源：天麻)、胡芦巴碱(trigonelline，来源：天麻)、柠檬醛(citral，来源：半夏)、茴香脑(anethole，来源：半夏)、α-细辛醚(α-细辛脑，α-asarone，来源：石菖蒲)、β-细辛醚(β-细辛脑，β-asarone，来源：石菖蒲)、细辛醛(asarylaldehyd，来源：石菖蒲)。

1.5 干预方式及样品采集

所有大鼠适应性饲养1周后，禁食10小时，自由饮水，取大鼠眶静脉取血约0.2 mL，记为0分钟。给予大鼠柴贝止痫汤9 mL/kg(折合生药药量8.125 g/kg)灌胃，分别于灌胃后15min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4h眼眶取血0.2 mL于抗凝管中，4℃离心机3000 rpm离心10 min分离血浆，-80℃保存以进行后续检测。

1.6 血浆样品处理

1.6.1 UPLC-MS/MS检测样品前处理 将血浆加入3倍沉淀剂沉淀蛋白，10000 rpm离心10 min后，取100 μL上清液进样5μL于液质，进行UPLC-MS/MS分析。

1.6.2 GC-MS/MS检测样品前处理 取待测血浆样品50 μL，加入含内标的乙酸乙酯：三氯甲烷(8∶2)萃取剂150 μL，涡旋混匀60秒，13000 rpm离心10 min，吸取上清液100 μL，吸取1 μL进行GC-MS测定。

1.7 UPLC-MS/ MS分析条件

1.7.1 UPLC条件 Thermo Syncronis C18，1.9 μm，2.1×100 mm色谱柱，液相条件：(1)A：水(含0.1%甲酸及2 mmoL/L甲酸铵)，D：乙腈；梯度洗脱，分析时间0～8min，进样量5 μL，流速0.25 mL/min。梯度条件见表1。

表1 UPLC检测梯度条件

1.7.2 MS/MS分析条件 电喷雾电离源ESI(+)；监测模式：二级数据依赖性扫描(Targeted-SIM)；喷雾电压：2800V；蒸发温度：350oC；鞘气：35Arb；辅助气：10Arb；毛细管温度：320oC；S-lens RF：50。

化合物参数：(1)原儿茶醛(-)：137.02442，贝母素甲(+)：432.34722，贝母辛(+)：428.31592，香草醛：151.04007，贝母素乙(+)：430.33157，对羟基苯甲醛(-)：121.02950；(2)柴胡皂苷A(-)：779.45871，天麻素(-)：321.07355，柴胡皂苷C(-)：925.51662，天麻苷元(-)：123.04515，柴胡皂苷D(-)：779.45871，普萘洛尔(IS+)：260.16451，甲苯磺丁脲(IS-)：269.09654。标曲浓度范围：0.001～500 ng/mL。

1.8 GC-MS/MS条件

载气为He气，恒流模式，流速为1 mL/min，进样量1 μL，气化室温度250℃，柱温为程序升温，起始温度为80℃，维持1 min，30℃/min升至250℃，维持1 min，30℃/min升至300℃，维持1 min，总测定时间10.33 min。MSD检测为MS/MS模式。

1.9 统计学处理

血浆浓度数据采用DAS 2.0软件进行计算参数：AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、MRT(0-∞)、t1/2、Tmax、Cmax。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 标准品色谱图及曲线线性范围 通过UPLC-MS/MS检测标准品：贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、柴胡皂苷A和D、柴胡皂苷C、对羟基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原儿茶醛标准品色谱图。见图1。绘制标准曲线，标曲浓度范围：0.001～500 ng/mL，标准曲线回归方程R2>0.998，提示在此范围内线性关系良好，可满足药物浓度定量分析的要求。

注：A：贝母素甲；B：贝母素乙；C：贝母辛；D：柴胡皂苷A和D；E：柴胡皂苷C；F：对羟基苯甲醛；G：天麻苷元；H：天麻素；I：香草醛；J：原儿茶醛；K：甲苯磺丁脲内标；L：普萘洛尔内标

注：A：胡芦巴碱；B：柠檬醛；C：茴香脑；D：α-细辛醚；E：β-细辛醚；F：细辛醛

GC-MS/MS检测标准品胡芦巴碱、柠檬醛、茴香脑、α-细辛醚、β-细辛醚、细辛醛色谱图，见图2，绘制标准曲线，标曲浓度范围：0.01～500 ng/mL，标准曲线回归方程R2>0.996，提示在此范围内线性关系良好，可满足药物浓度定量分析的要求。

2.1.2 日内、日间精密度及回收率 柴贝止痫汤主要单体成分：贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、柴胡皂苷A和D、柴胡皂苷C、对羟基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原儿茶醛、胡芦巴碱、柠檬醛、茴香脑、α-细辛醚、β-细辛醚、细辛醛17个标准品日内精密度和日间精密度RSD<5%，回收率在97%～103%，符合定量分析要求。

2.2 柴贝止痫汤不同时间点入血成分浓度定量检测

17种标准品检测柴贝止痫汤不同时间点入血成分，检测出15种化合物，分别是贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、对羟基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原儿茶醛、胡芦巴碱、茴香脑、α-细辛醚、β-细辛醚、细辛醛。柠檬醛及柴胡皂苷D在各个采血点均未检测出，通过各个标准品回归方程定量计算各化合物不同时间点浓度。见表2。

表2 柴贝止痫汤主要入血成分不同时间点浓度均值结果(ug/L)

2.3 柴贝止痫汤入血成分平均血浆药-时曲线

采用DAS2.0软件绘制柴贝止痫汤入血成分平均血浆药-时曲线，血浆药-时曲线呈现为一个单峰曲线，曲线在0.25小时达到最高峰。见图3。

图3 柴贝止痫汤入血成分平均血浆药-时曲线

2.4 柴贝止痫汤入血吸收成分药代动力学参数

通过DAS2.0软件，分析柴贝止痫汤15种入血成分不同时间点的药代动力学参数：AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、MRT(0-∞)、t1/2、Tmax、Cmax，结果见表3。柴贝止痫汤15种入血成分入血含量由高到底排列依次为：天麻素、对羟基苯甲醛、胡芦巴碱、天麻苷元、原儿茶醛、柴胡皂苷A、香草醛、细辛醛、贝母素乙、α-细辛醚、茴香脑、β-细辛醚、柴胡皂苷C、贝母素甲、贝母辛，含量显著高于其他成分的天麻素、对羟基苯甲醛、胡芦巴碱、天麻苷元等均为天麻的有效成分。15种入血成分Tmax多集中在0.25或0.5小时，t1/2分布范围差异较大，其均值为4.28小时。

表3 柴贝止痫汤15种入血成分的药代动力学参数

3 讨论

癫痫属于中医“痫证”的范畴，现代医家认为痰浊内阻，脏气不平，阴阳偏胜，神机受累，元神失控是癫痫的关键病机。本团队收集耐药性癫痫患者的一般情况及中医四诊信息，应用因子分析法进行统计学分析，发现耐药性癫痫患者以痰气郁滞证所占比例最高[9]，认为理气化痰是癫痫主要治则之一[10]，拟定柴贝止痫汤治疗耐药性癫痫证属痰气郁滞证患者。团队通过随机双盲临床对照试验发现，在常规抗痫西药的基础上添加柴贝止痫汤治疗，与单纯采用抗痫西药相比，患者癫痫发作频次、癫痫积分、癫痫发作伴随症状积分均较治疗前显著下降[2]。

此外，添加柴贝止痫汤治疗耐药性癫痫，对患者疲劳、发作恐惧、社会支持、药物不良反应4项具有一定的改善作用[3]，随着疗程的延长，疗效逐渐显著，未发现不良反应[4]。动物实验同样证实了柴贝止痫汤具有抗痫作用[5-8]。然而中药复方具有多成分、多靶点、多途径的特点，柴贝止痫汤中有效成分数量庞大，对组方药效物质基础的研究有助于筛选到柴贝止痫汤的主要效应成分，对组方精简及抗癫痫新药的研发就有重要的意义。

本研究发现了柴贝止痫汤的15个吸收入血成分，按照血药浓度高低依次为天麻素、对羟基苯甲醛、胡芦巴碱、天麻苷元、原儿茶醛、柴胡皂苷A、香草醛、细辛醛、贝母素乙、α-细辛醚、茴香脑、β-细辛醚、柴胡皂苷C、贝母素甲、贝母辛。其中排名前五位的天麻素、对羟基苯甲醛、天麻苷元、原儿茶醛均为天麻的主要吸收成分，天麻味甘平，归肝经，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，在柴贝止痫汤中为君药，《神农本草经》记载其“味辛温，主杀鬼精物，蛊毒，恶气，久服益气力，长阴肥健，轻身增年”。天麻是治疗癫痫最常用的中药之一，现代医学研究表明天麻可以使戊四氮诱导的癫痫模型大鼠癫痫发作潜伏期延长、发作持续时间缩短，降低大鼠脑组织凋亡相关蛋白表达，发挥神经保护作用[11]。其他研究同样证实了天麻的抗癫痫作用及神经保护作用[12]，其主要成分天麻素可以通过激活PI3K/AKT信号通路保护过氧化氢诱导的神经细胞氧化损伤[13]，干预中枢神经系统内兴奋性或抑制性神经递质释放、调控Nrf2/ERK的表达，下调氧化应激酶类血红素加氧酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等的作用、抑制胶质细胞产生神经炎症因子白细胞介素、肿瘤坏死因子等以达到保护神经元的目的[14]。柴贝止痫汤中的其他入血吸收成分如α-细辛醚、β-细辛醚、原儿茶醛等同样具有一定的抗痫作用[15-16]，并能调节突触可塑性，一定程度改善认知功能[17]。胡芦巴碱、柴胡皂苷等具有抗炎、抗氧化的作用，可抑制核因子κB信号通路发挥抗炎作用[18]。

本研究借助UPLC-MS/MS及GC-MS/MS技术发现了柴贝止痫汤的15个主要吸收入血成分及其药代动力学特征，下一步可借助网络药理学等研究方法，对入血吸收成分的作用靶点及疾病治疗靶点做相关性分析，以进一步揭示柴贝止痫汤抗痫作用的潜在物质基础，并通过实验研究加以验证，为耐药癫痫的治疗及新药研发提供基础。