基于网络药理学探讨桂芍配伍治疗骨关节炎的作用机制

陈谱 阮安民 周俊 张晓哲 王庆甫

桂枝与白芍配伍最早见于《伤寒论》，张仲景在桂枝汤的基础上，运用不同比例的桂枝与白芍，衍化出了小建中汤、桂枝加葛根汤等著名方剂。在前期研究中笔者对比了不同比例的桂枝与白芍对骨关节炎(Osteoarthritis，OA)中滑膜炎症的影响，结果显示“桂枝—白芍”配伍可以显著抑制骨关节炎滑膜炎症程度[1-2]。然“桂枝—白芍”配伍究竟如何影响到骨关节炎，其内在作用机制尚未见报道。网络药理学是一种利用现有文献基础和网络生物信息学，从多成分、多靶点以及多通路的角度出发，构建“药物—成分—靶点—疾病”网络，探讨多种中药成分与疾病之间的相互作用机制，比较适合单味中药及复方研究的新兴学科[3-4]。因此本研究拟通过网络药理学技术初步探讨“桂枝—白芍”配伍对骨关节炎的作用机制，为后续研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 获取桂枝—白芍药对活血成分及潜在治疗靶点

中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)数据库[5]是一种基于传统中草药系统药理学而建立的中药系统药理学数据库与分析平台，能捕捉药物、靶标和疾病之间的关系，其内包括499味中药以及29000个中药有效成分。药物成分靶标数据库(herb ingredients’ targets，HIT)[6]是一个包括用于补充美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的药物的蛋白质靶标和有潜在治疗意义的数据库，包含大约1301个已知的蛋白质靶点，涵盖了1300多种著名中草药中的约586种活性化合物。笔者通过在TCMSP数据库中搜索“桂枝”“白芍”，根据口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%以及类药性(Drug-Likeness,DL)≥0.18进行筛选，将得到的生物活血成分进行整理并统计活性成分相对应的靶基因。再将得到的活性成分放入HIT中进行检索，再次收集活性成分相对应的靶基因，使用Excel整理数据。

1.2 骨关节炎治疗靶点获取

治疗靶点数据库(Therapeutic Target Database，TTD)[6]以及Drug Bank数据库[7]是两个常用的包括疾病靶点和药物信息的数据库，既有成功的临床药物靶点，亦有在研药物靶点，其内信息均经过试验验证，具有较强的可行性。Gene Cards[8]是一个整和网络资源的基因数据库，内有全面的所有关于人类的基因注释信息和预测信息，信息较全。笔者在这三个数据库中以“osteoarthritis”为检索词，获取每个靶点的全称、简称以及UniProt号，使用Excel将得到的靶点信息进行整和。

1.3 构建“药物—成分—靶点—疾病”网络

将骨关节炎治疗靶点与桂枝、白芍药对治疗靶点用Excel进行合并，提取出重复值，重复值即为桂枝—白芍药对治疗OA的靶点。以药物有效成分和桂枝—白芍药对治疗OA的靶点为节点，在Excel表格中建立关系，导入Cytoscape 3.7.2软件中建立“桂枝—白芍”与治疗靶点之间的相互作用网络。

1.4 KEGG通路富集分析

将桂枝—白芍药对治疗OA的靶点在David网站[9]中进行KEGG(京都基因与基因组百科全书)富集，使用R语言对P值进行校正并选择前20条通路进行气泡图展示，进一步探讨桂枝—白芍治疗OA过程中的信号通路。

1.5 GO富集分析

在Cytoscape软件中下载安装“BiNGo”以及“MCODE”插件。首先对桂枝—白芍药对治疗OA的靶点进行基因本体(Gene Ontology，GO)生物过程富集，包括生物学过程(BP，Biological Process)、细胞组分(CC，Cellular Component)、分子功能(MF，Molecular Function)，对P值进行校正后再对所有具有统计学意义的GO生物过程进行富集分析。

2 结果

2.1 桂枝—白芍药对活血成分及潜在治疗靶点

在TCMSP数据库中，以口服利用度(OB)≥30%以及类药性(DL)≥0.18为筛选条件检索到7种桂枝有效成分、13种白芍有效成分，且桂枝与白芍之间具有3个共同有效成分，具体详见表1～2。将检索到的有效成分在TCMSP及HIT数据库上收集相应的治疗靶点，Excel整理查重后共有90个治疗靶点。

表1 TCMSP数据库中桂枝有效成分

表2 TCMSP数据库中白芍有效成分

2.2 桂枝白芍治疗骨关节炎靶点

通过检索TTD、DrugBank以及GeneCards数据库，在GeneCards数据库中以分值≥1为筛选条件，Excel整理取出重复值，共筛选出骨关节炎潜在治疗靶点1307个。将桂枝—白芍药对治疗靶点与骨关节炎治疗靶点进行匹对，共发现靶点40个，详见表3。

表3 桂枝—白芍药对治疗骨关节炎靶点

续表3

2.3 “药物—成分—靶点—疾病”网络

将桂枝与白芍的每个有效成分和其相对应治疗靶标导入Cytoscape软件中，绘制成分—靶点对应图形，以浅黄色为自由度较小的颜色，红色为自由度较高的颜色。结果显示桂枝—白芍药对中前五位活血成分一次为MOL000358(β-谷甾醇)、MOL000422(山柰酚)、MOL000359(谷甾醇)、MOL000492(儿茶酸)、MOL004576(黄杉素)，详见图1。

注：图中方形代表药物成分，圆形代表靶点

2.4 KEGG通路富集分析

将关键靶基因在David网站中进行KEGG通路富集，共富集出通路93条，使用R语言对P值进行校正并选择前20条通路进行气泡图展示，见图2。结果显示桂枝—白芍药对治疗OA的信号通路包括癌症、乙型肝炎、肿瘤坏死因子等通路，还包括细胞凋亡、结直肠癌、Toll样受体等信号通路。

图2 KEGG通路富集分析

2.5 GO富集分析

将获得的关键靶基因放入David网站上进行GO富集分析，选择生物学过程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)以及细胞组分(Cellular Component,CC)三个内容。分析结果如图3～5所示，桂枝白芍的靶点在BP上主要是在药物反应、雌二醇、衰老以及激活NF-κB信号通路等；在MF上主要表现为类固醇激素受体活性、单氧酶活动以及过氧化物酶活性；在CC上主要位于胞质、膜筏及细胞器膜上。

图3 GO富集分析—生物学过程(BP)

图4 GO富集分析—分子功能(MF)

图5 GO富集分析—细胞组分(CC)

3 讨论

OA是一种以滑膜炎症、软骨进行性退变并累计关节软骨下骨的退行性肌肉骨骼疾病，其主要症状有关节疼痛、僵硬以及功能障碍[10-12]。国际卫生组织发布的流行病学显示OA是全世界十大致残原因之一[10]，随着中国逐步步入老龄化社会，中国OA患者也呈逐年增加的趋势。虽然治疗OA的方法众多，然目前仍无一种方法可以逆转或者暂止OA的发生与发展[12-15]。因此研究OA的发病机理，探索治疗OA的作用机制具有重要社会意义。

“桂枝—白芍”是中医学常见的配对用药之一，桂枝辛散调卫阳，白芍酸涩和营阴，桂芍配伍可调和营卫、温经和血。张仲景即在黄芪桂枝五味汤中连用桂芍，取其调营卫、治阴阳以治阴阳举微之血痹。现代药理学显示，桂枝中的有效单体桂皮醛具有显著的抑制炎症、免疫调节、抗氧化、抗糖尿病等作用[16-18]；白芍的提取物白芍总苷可以抗炎止痛、调节免疫[19-22]。笔者团队在传承经典的基础上，结合现代药理学证据，以“桂枝—白芍”为君药组方通络止痛方，取其抑制炎症、调节免疫之效用于治疗OA，取得显著效果。在北京市科委和国自然的资助下，团队在不同层面上对通络止痛方上治疗OA的疗效进行了验证[1-2，23-24，26-29]。在细胞层面上，通络止痛方可以显著抑制滑膜细胞炎症，其中君药有效成分可以抑制滑膜细胞增殖并促进其凋亡，且桂枝白芍联合用药效果显著高于单味组[22，25，27]；在动物层面上，低频超声促透通络止痛方可以显著抑制大鼠膝骨关节炎骨关节炎中的炎性因子表达[28-29]；在临床研究上，超声电导通络止痛方可以显著降低早期膝骨关节炎患者疼痛评分并提高患肢功能[25]。然而通络止痛方如何治疗OA，君药“桂枝—白芍”通过哪些信号通路影响到OA，目前暂不清楚。

本文从网络药理学及生物信息学出发，探讨“桂枝—白芍”药对治疗骨关节炎的潜在治疗机制。本次研究在“桂枝—白芍”药对中共检索出17种有效治疗成分，映射治疗OA靶标40个。在“药物—成分—靶点—疾病”网络中发现有5种有效成分最为显著，即β-谷甾醇、山柰酚、谷甾醇、儿茶酸和黄杉素，而其中有3种有效成分同时存在于桂枝与白芍之中，这可能是“桂枝—白芍”联合用药效果更佳的潜在原因。KEGG通路富集分析显示其潜在治疗可能与癌症、乙型肝炎、肿瘤坏死因子通路有关，在这些通路中MAPK、Jak/STAT、ERK、NF-κB以及自噬等经典通路相互交联。GO富集分析显示“桂枝—白芍”在生物学过程中主要是激活药物反应应答、衰老、抗氧化以及调节NF-κB通路、ERK信号通路等；在分子功能上主要是激活类固醇激素受体与过氧化物酶活性，这与KEGG结果显示相符，也与之前文献报道相吻合。

综上所述，本研究以经典药对“桂枝—白芍”为研究对象，利用网络药理学和生物信息学相关技术，探讨了“桂枝—白芍”药对所包含的有效成分以及治疗骨关节炎的潜在靶点及相关信号通路，构建药物成分靶点网络并进行KEGG和GO富集分析，阐述了“桂枝—白芍”治疗骨关节炎的潜在作用机制，为进一步深入研究“桂枝—白芍”药对作用提供了参考。