猪CXCL10基因SNPs与仔猪腹泻和生长性状关联分析

牛步月，刘 路，陈志华，姚迪文，狄生伟，王希彪

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030）

仔猪腹泻严重危害养猪业，并造成巨大经济损失。随着全球对减少药物和疫苗使用呼声越来越高，通过抗病育种提高机体自然抗病力成为研究重点。

趋化因子（Chemokines）是一类由细胞分泌的蛋白，可诱导细胞发生定向迁移。C-X-C基序趋化因子10（C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10）也称为干扰素γ诱导蛋白10（Interferon gamma-induced protein 10,IP-10）或小诱导细胞因子B10（Small-inducible cytokine B10），蛋白大小为8.7 ku[1-2]。CXCL10由CD4+T细 胞、NK和NKT细 胞、单核细胞、树突状细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞等分泌[3-4]。研究发现，IFN（Interferon）、TNF-α（Tumor necrosis factor-α）等刺激物可诱导CXCL10分泌，放大炎症级联反应[5]。

CXCL10是趋化因子CXCR3（C-X-C motif chemokine receptor 3）配体，研究发现CXCR3/CXCL10轴是促进免疫细胞进入炎症组织的关键趋化因子轴之一，与炎症性疾病，特别是肠道炎症有强相关性[6-7]。炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种特发性肠道炎症性疾病，会累及回肠、直肠、结肠，肠道黏膜免疫系统异常反应，炎症反应在IBD发病中起主要作用。IBD主要包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn disease，CD）两个独立疾病。人类医学研究发现CXCL10在健康人群结肠上皮细胞中呈组成性表达，但在UC和CD患者结肠上皮细胞中高度表达[8-9]；这种差异表达机制在于CXCL10通过与CXCR3受体结合，促进Th1细胞分化并将其趋化到发生炎症的结肠组织[10]。

猪病学研究发现CXCL10在免疫反应中发挥关键作用[11-12]。研究者分别用高毒力和低毒力非洲猪瘟病毒分离株感染猪后，发现猪CXCL10 mRNA表达水平显著增加，通过诱导细胞活化、趋化性和淋巴细胞向Th1表型致敏，而在不同病毒感染期间发挥重要作用，对于建立有效免疫反应非常重要[13]。

产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起仔猪细菌性腹泻主因。Zhou等使用F4ab、F4ac和F18ac 3种血清型ETEC感染IPEC-J2，发现F4ac和F18ac感 染IPEC-J2后，CXCL10基因表达量上调[14]。C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringenstype C，C.perfringenstype C）是引起仔猪腹泻的另一种主要病原菌，其外毒素引起新生仔猪红痢。Huang等利用C.perfringenstype C感染7日龄仔猪，根据仔猪粪便评分将感染猪分为抗性组和敏感组，经高通量测序和荧光定量PCR检测发现CXCL10基因在抗性组回肠组织表达量高于敏感组[15]。根据CXCL10基因在免疫应答中重要作用，Huang等选择CXCL10基因作为猪一般抗病力候选基因，研究猪CXCL10基因关键外显子区域遗传变异，发现3′UTR存在SNP c.407T＞C，性状关联分析发现该SNP与淋巴细胞百分比、血细胞比容、平均红细胞量等血液参数性状显著相关[16]。该位点对哺乳仔猪腹泻和生长性状的影响未见报道。

DNA元件百科全书（Encyclopedia of DNA elements,Encode）项目通过对人类基因组元件识别和注释，发现与疾病等复杂性状相关联遗传变异主要位于基因非编码区域[17]。大量研究证实，基因5′调控区域在基因精准转录和表达过程中发挥重要作用，目前关于猪CXCL10基因启动子区域遗传变异研究未见报道。鉴于此，本研究利用直接测序分析民猪和长白猪CXCL10基因5′侧翼区域遗传变异，建立针对遗传变异的检测技术，并在民猪和长白猪群体中展开5′侧翼区域、3′UTR遗传变异与哺乳仔猪腹泻和生长性状关联分析，以期为猪育种工作提供新基因标记和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用基因组DNA为基础科研平台猪遗传育种研究室保存的民猪和长白猪耳组织DNA。试验猪群在相同条件下饲喂，35日龄断奶。记录哺乳仔猪初生重，3、7、14、21、28和35日龄体重，计算仔猪平均日增重[ADG=（35日龄断奶重-初生重）/35]。仔猪在哺乳期间，观察每日粪便性状，根据粪便形状确定哺乳仔猪腹泻评分。具体评分标准如下：粪便外观呈条状或粒状，为正常腹泻，评分为0；粪便外观呈软便、成形，为轻度腹泻，评分为1；粪便外观呈稠状粪水无分离现象、稀便，为中度腹泻，评分为2；粪便外观呈液体、不成形、粪水分离，黏液便或脓便，为重度腹泻，评分为3[18]。记录仔猪腹泻评分，计算哺乳仔猪从出生至35日龄腹泻评分总和。腹泻指数=粪便状况评分之和/供试验仔猪总头数。腹泻指数越高，则试验仔猪腹泻越严重。

1.2 试验试剂

DL2000 DNA Maker、DL5000 DNA Maker、PMD™18-T Vector Cloning Kit、NdeⅠ和MspⅠ限制性核酸内切酶均购自TaKaRa公司；Trans1-T1 Chemically Competent Cell、Trans DNA MakerⅠ均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Axygen公司；2×TaqMaster Mix（Dye Plus）购自Vazyme公司；Agarose-Molecular Biology Grade购自Invitrogen公司。

1.3 引物设计与合成

在NCBI和Ensemble数据库查询猪CXCL10基因。初步分析发现起始密码子ATG位于第一外显子，第一外显子全长为121 bp。下载包含猪CXCL10基因起始密码子ATG上游2 000 bp、第一外显子和第一内含子序列，以此序列为模板，利用Primer 5.0设计引物CXCL10-5′-F/R，用于扩增5′侧翼区域序列；设计引物CXCL10-1F/R用于在民猪和长白猪群体中检测SNP rs337535939位点。按照文献[16]合成引物CXCL10-2F/R用于CXCL10基因3′UTR区域SNP c.407T＞C位点检测（见表1）。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 猪CXCL10基因引物Table 1 Primers used for porcine CXCL10 gene amplification

1.4 猪CXCL10基因5′侧翼区遗传变异和转录因子结合位点分析

根据哺乳仔猪腹泻记录，分别选取严重腹泻和健康未腹泻民猪和长白仔猪各5头，分别以这20头猪基因组DNA为模板，利用引物CXCL10-5′-F和CXCL10-5′-R作CXCL10基因5′侧翼区扩增。

PCR反应体系总体系为20μL，包括10μL 2×TaqMaster Mix（Dye Plus），1μL基因组DNA，各0.8μL上下游引物，7.4μL灭菌水。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57.7℃退火60 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

PCR扩增结束后，用浓度为1.5%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物电泳检测。按照凝胶回收试剂盒说明书，作PCR扩增产物回收和纯化。纯化后产物与PMD18-T连接，转化至感受态细胞，挑取阳性克隆菌液经PCR鉴定后，送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

利用Clustal Omega在线软件对10头民猪和10头长白猪测序结果作多重序列比对，分析寻找遗传变异位点。使用在线软件AnimalTFDB3（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/tfbs_predict）预测CXCL10基因5′侧翼区域转录因子结合位点，进一步分析遗传变异位点是否引起转录因子结合位点改变。利用DNA Club软件分析遗传变异是否引起特异限制性内切酶酶切位点变化。

1.5 PCR-RFLP检测

利用引物CXCL10-1F/R作CXCL10基因5′侧翼区域扩增，取8.5μL PCR扩增产物，0.5μLNdeⅠ限制性内切酶，1μL Buffer构成NdeⅠPCR-RFLP反应体系。利用引物CXCL10-2F/R作CXCL10基因3′UTR扩增，取8.5μL扩增产物，0.5μLMspⅠ限制性内切酶，1μL Buffer构成MspⅠPCR-RFLP反应体系。两种混合体系均于37℃水浴5 h，之后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统采集图像，根据图像结果分析并判断基因型。

1.6 数据分析

利用popgene 1.32分别计算两个SNPs位点在民猪和长白猪群体中基因型频率、等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度和有效等位基因数。

采用SAS统计软件（Version 9.4）一般线性模型中GLM程序分别作两个SNPs位点与民猪和长白猪哺乳仔猪腹泻评分和生长性状表型值关联分析，建立模型如下：

Yij表示仔猪腹泻评分和生长性状表型值，u表示群体均值，Gi表示基因型效应，eij表示随机残差效应。

2 结果与分析

2.1 猪CXCL10基因多态性和性状关联分析

2.1.1 猪CXCL10基因5′调控区克隆

以猪基因组DNA为模板，设计引物对CXCL10基因5′调控区1 639 bp近端序列作PCR扩增。PCR产物经凝胶电泳检测得到单一明亮条带（见图1），且条带长度与预期结果1 639 bp相近。对PCR产物纯化、克隆和测序，经序列比对获得1 639 bp片段，该片段包含1 477 bp ATG上游区域，121 bp外显子1和101 bp内含子1。

图1 猪CXCL10基因扩增产物电泳图谱Fig.1 Agarosegel photograph of CXCL10 in pig

2.1.2 猪CXCL10基因5′侧翼区域遗传变异和转录因子结合位点分析

分别以严重腹泻和健康未腹泻民猪和长白仔猪基因组DNA为模板，利用引物CXCL10-5′-F/R作PCR扩增，将PCR产物分别回收、纯化、克隆和测序。比对分析序列测序结果发现，通过PCR扩增获得1 639 bp猪CXCL10基因5′侧翼区域存在15个遗传变异，分别位于ATG上游-1341（C/T）、-1338（G/A）、-1040（A/G）、-1022（G/A）、-977（-/G）、-971（T/A）、-832（T/G）、-808（A/G）、-681（G/C）、-666（----/CCAA）、-552（T/A）、-551（-/G）、-462 bp（-/A/C）、-159（A/G）以及+6（C/T）。

利用AnimlTFDB3在线软件对该序列预测转录因子结合位点，发现5个SNPs位点引起转录因子结合能力改变（见表2），5个SNPs中rs346260249、rs337535939、rs339657065和rs331393857均 多 发于民猪群体，10头测序民猪中有6头在这11个位点发生碱基突变，而测序10头长白猪中仅1头在此位点处发生碱基突变（见表3）。进一步分析发现SNP rs337535939引起转录因子MLXIPL和NHLH1结合能力改变（见表2）。当SNP rs337535939为G时，存在MLXIPL和NHLH1结合位点；当SNP rs337535939为A时，MLXIPL结合位点消失，NHLH1结合能力下降（见表2）。结合民猪和长白猪测序结果分析发现，在10头测序长白猪中，仅1头为A等位基因；而在10头参与测序民猪中，6头为A等位基因；在10头测序健康个体中，4头民猪和1头长白猪为A等位基因；10头参与测序严重腹泻个体中，2头民猪为A等位基因（见图2）。

SNP rs335118294和SNP rs339657065均引起转录因子EP300结合能力变化。当SNP rs335118294和SNP rs339657065发 生AG突变时，EP300结合能力均下降（见表2）。结合民猪和长白猪测序结果分析发现，对于SNP rs335118294，10头测序长白猪中，3头为G等位基因；而在10头参与测序民猪中，7头为G等位基因；10头测序健康个体中，3头民猪和2头长白猪为G等位基因；10头参与测序严重腹泻个体中，1头长白猪和4头民猪为G等位基因（见表3）。对于SNP rs339657065，10头测序长白猪中，仅1头为G等位基因；而在10头参与测序民猪中，6头为G等位基因；10头测序健康个体中，4头民猪和1头长白猪为G等位基因；10头参与测序严重腹泻个体中，2头民猪为G等位基因（见表3）。

进一步分析发现，SNP rs337535939引起NdeⅠ酶切位点（CA|TATG）改变，当SNP rs337535939为G等位基因时，存在NdeⅠ酶切位点；当SNP rs337535939为A等位基因时，NdeⅠ酶切位点消失（见图2）。

表2 猪CXCL10基因5'侧翼区SNPs引起转录因子结合位点变化Table 2 Changes of transcription factor binding sites caused by SNPs in the 5'flanking region of porcine CXCL10 gene

表3 民猪和长白猪CXCL10基因SNPs统计Table 3 Summary of SNPs in CXCL10 gene of Min and Landrace piglets

图2 CXCL10基因5′侧翼区中检测到SNP rs337535939Fig.2 SNP rs337535939 in 5′flanking region of the CXCL10 gene

2.1.3 猪CXCL10基因PCR-RFLP分析

以民猪和长白猪基因组DNA为模板，利用引物CXCL10-2F/R作PCR扩增获得猪CXCL10基因包含SNP rs337535939位点共849 bp5′侧翼区域片段，用限制性内切酶NdeⅠ对扩增产物消化，经琼脂糖凝胶电泳后产生3种基因型。分别是AA基因型（849 bp）、GG基因型（230、619 bp）和AG基因型（230、619、849 bp）（见图3）。

对于报道的CXCL10基因3′UTR SNP位点c.407T＞C，以文献[16]报道引物扩增获得497 bp片段，用限制性内切酶MspⅠ对扩增产物消化，琼脂糖凝胶电泳检测发现共存在3种基因型，分别是TT基因型（497 bp）、CC基因型（378、119 bp）和TC基因型（378、11、497 bp）（见图4）。

图3 CXCL10基因NdeⅠPCR-RFLP基因型分型结果Fig.3 NdeⅠPCR-RFLP genotyping results of CXCL10 gene

图4 CXCL10基因SNP c.407T＞C MspⅠPCR-RFLP基因型分型结果Fig.4 SNP c.407T＞C MspⅠPCR-RFLP genotyping results of CXCL10 gene

2.1.4 猪CXCL10基因SNPs群体遗传结构分析

在民猪和长白猪群体中分析CXCL10基因两个SNPs基因型频率、等位基因频率、杂合度和多态信息含量等群体遗传参数。如表4所示，SNP rs337535939在民猪群体中存在AA、AG和GG 3种基因型，基因型频率分别为0.22、0.56和0.23；A等位基因频率为0.49，观测杂合度为0.56，该位点在长白猪群体中仅检测到4个AA基因型个体，AA基因型频率为0.02，A等位基因频率为0.18，观测杂合度为0.32。SNP c.407T＞C在民猪群体中存在TT、TC和CC 3种基因型，基因型频率分别为0.17、0.61和0.21；T等位基因频率为0.48，观测杂合度为0.60，该位点在长白猪群体中仅检测到4个TT基因型个体，TT基因型频率为0.02，T等位基因频率为0.12，观测杂合度为0.20。观测杂合度（Ho）=观察得到杂和个体数/样本个体数总数。SNP rs337535939和SNP c.407T＞C的期 望 杂合度（Expected heterozygosity，He）在民猪和长白猪中分别为0.50、0.30；0.50，0.21。这两个SNPs在两个群体中多态信息含量（Polymorphism information content，PIC）值分别为0.37、0.25；0.37、0.19。按照PIC多态评分标准（PIC＞0.5为高度多态,0.25＜PIC＜0.5为中度多态，PIC＜0.25为低度多态），本研究新鉴定SNP rs337535939和报道SNP c.407T＞C在民猪群体中均为中度多态，而在长白猪群体中为低度多态。

表4 CXCL10基因SNPs在民猪和长白猪群体中群体遗传参数Table 4 Population genetic parameters of SNPs of the CXCL10 gene in Min and Landrace piglets

2.1.5猪CXCL10基因SNPs与哺乳仔猪腹泻和生长性状关联分析

性状关联分析结果表明，CXCL10基因SNP rs337535939与民猪仔猪7、14、21、28、35日龄体重以及日增重相关（见表5）；与长白仔猪腹泻指数、14、28、35日龄体重和日增重相关（见表5）。在民猪群体中，SNP rs337535939各种基因型个体抗腹泻能力差异不显著；GG基因型仔猪35日龄断奶重和日增重分别比AA基因型个体高0.75 kg和30 g（P＜0.05）。在长白猪群体中，GG型仔猪抗腹泻能力与AA型差异不显著，显著低于AG杂合子个体（P＜0.05）；GG基因型个体35日龄断奶重和日增重分别比AA基因型个体高3.36 kg和0.08 kg（P＜0.05）。

CXCL10基因3′UTR区域SNP c.407T＞C与民猪和长白仔猪腹泻和生长性状均无相关性。在长白猪群体中TT、TC和CC日增重分别为140、190和200 g，TT基因型个体与CC基因型个体日增重相差60 g。在民猪和长白猪群体中，与TT基因型个体比较，CC型个体具有较低腹泻指数、较高35日龄断奶重和日增重（见表6）。

表5 CXCL10基因SNP rs337535939与民猪和长白仔猪腹泻指数和生长性状关联分析Table 5 Association analysis of CXCL10 gene SNP rs337535939 with diarrhea index and performance traits in Min and Landrace piglets

表6 CXCL10基因c.407T＞C与民猪和长白仔猪腹泻指数和生长性状关联分析Table 6 Association analysis of CXCL10 gene SNP c.407T＞C with diarrhea index and performance traits in Min and Landrace piglets

3 讨论

本研究通过直接测序在CXCL10基因5'侧翼区域鉴定出13个SNPs，其中g.71696440以及2个插入突变为新发现，其他10个SNPs在Ensembl的SNPs数据库中已标注。对这些遗传变异位点分析转录因子结合位点，发现SNP rs337535939由G到A碱基突变引起转录因子MLXIPL（MLX interacting protein like，MLXIPL）结合位点变化。MLXIPL也称为碳水化合物反应性元素结合蛋白（Carbohydrate-responsive element-binding protein，ChREBP）[19]，该基因编码Myc/Max/Mad超家族的基本螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子。研究发现MLXIPL可直接激活多个参与糖酵解和脂肪合成基因表达，调控糖代谢和脂肪酸合成[20]。

转录因子结合位点变化可能影响基因转录效率并最终导致表型性状改变，因此本试验深入分析SNP rs337535939。通过序列比对分析发现该SNP多发于民猪群体；10头测序长白猪中，仅1头为A等位基因；而10头参与测序民猪中，6头为A等位基因。这表明民猪群体具有较高遗传变异，长白猪经长期人工选育后，在分子水平遗传变异降低。

群体遗传学分析发现在民猪和长白猪群体中G（或C）等位基因频率均高于A（或T）。性状关联分析证实，GG型民猪和长白仔猪35日龄体重和日增重（ADG）均高于AA型个体。GG型长白猪腹泻指数低。民猪和长白猪群体研究表明，选育GG型个体（或淘汰AA型个体）可降低腹泻发生，提高仔猪日增重。

民猪广泛分布于东北地区，与引入品种相比较，具有抗逆性强、繁殖力高、耐粗饲、肉质好等优良特性。本研究发现长白猪SNP rs337535939G等位基因频率高于民猪群体，在检测长白猪群体中，仅有4个AA基因型个体。长白猪是著名引入品种，推测在长期人工选育过程中，具有高生长速度GG型个体得到选择，而低断奶重和日增重AA型个体被淘汰；民猪由于未经严格人工选育，其群体中仍存在一定数量AA基因型个体。

仔猪出生时脂肪组织中脂肪沉积量较小，但在哺乳期脂肪快速沉积。近年研究表明，转录因子MLXIPL在猪脂肪和能量代谢中发挥作用。Zhang等发现葡萄糖可直接通过ChREBP诱导猪前脂肪细胞中脂肪生成和成脂基因表达[21]；高糖条件下，MLXIPL在猪皮下前脂肪细胞表达量高于肌内前脂肪细胞[22]。转录因子结合位点预测分析发现MLXIPL可与GG型个体CXCL10基因启动子区域结合，性状关联分析表明GG型个体具有高抗腹泻能力、断奶重和日增重。MLXIPL是否通过SNP rs337535939影响CXCL10基因转录调控，进而影响哺乳仔猪抗病能力和生长性状，有待后期深入研究。

人类医学研究发现CXCL10启动子区域SNPs（-135G＞A[rs56061981]和-1447A＞G[rs4508917]）影响血浆CXCL10基因表达水平，与脑型疟疾等疾病易感性相关[23]。本研究在猪CXCL10启动子区域预测到STAT、EP300等多种促炎性转录因子结合位点，其中预测EP300结合区域存在两个SNP（rs335118294和rs339657065）。EP300可作为一种组蛋白乙酰转移酶，通过染色质重塑调节基因转录，在细胞增殖和分化过程中发挥表观调控作用。陈梦等研究发现EP300高表达可通过调节H3K27ac修饰，促进CXCL10基因表达，影响小鼠肠道炎症发生发展[24]。下一步可深入研究SNPrs335118294和rs339657065功能，分析EP300是否通过组蛋白修饰调控猪CXCL10基因表达参与仔猪腹泻遗传调控。

Huang等分析CXCL10基因SNP c.407T＞C与不同品种猪血红蛋白浓度相关性时，发现该SNP与20日龄仔猪血液中淋巴细胞百分率、80日龄生长猪血细胞比容和平均红细胞量显著相关（P＜0.05）；与80日龄生长猪血液中血红蛋白浓度极显著相关（P＜0.01），而红细胞在免疫反应中起作用，表明该SNP对免疫反应有影响[16]。本研究通过性状关联性分析发现SNP c.407T＞C与民猪和长白仔猪腹泻和生长性状均无相关性（P＞0.05），但在长白猪群体中TT、TC和CC日增重分别为140、190和200 g，TT基因型个体与CC基因型个体日增重相差60 g。性状关联分析结果不显著极有可能因为试验群体不够大。该结果表明利用该标记对免疫性状选择，不影响哺乳仔猪抗腹泻能力，可能对生长性能存在影响。

4 结论

本研究在猪CXCL10基因启动子区域发现15个SNP位点，转录因子预测发现其中SNP rs337535939引起MLXIPL转录因子结合位点改变，建立针对该SNP位点NdeⅠPCR-RFLP分型技术。性状关联分析发现猪SNP rs337535939位点影响民猪和长白猪断奶重和日增重，影响长白猪仔猪腹泻；SNP c.407T＞C对民猪和长白猪抗腹泻能力和断奶重等经济性状无负面影响。