大血小板检测在移植后急性排斥反应的意义研究

雷健，伍柏青，杜宇娜，李蓉

（江西省人民医院、南昌医学院第一附属医院，江西 南昌 330006）

血液学参数在血液常规检查中一直被认为是全身炎症反应的标志[1-2]。血小板检验，作为血常规检验的一部分，对患者移植后的评估具有重要临床意义[3]。BECKMAN COULTER DXH800全自动血细胞分析仪（简称UniCel DxH 800）是一款在临床实验室中使用较多的血液分析仪，它通过应用全新的专利技术和设计，提高了仪器的准确度、精确度、敏感性和特异性，但我们在临床检验工作中发现其在血小板参数的检验方面仍有不足。器官移植术后的急性排斥反应(Acute rejection,AR)增加了移植物功能不全的风险，是影响移植物长期存活的主要因素。研究表明，大血小板的检测对实行移植手术后的急性排斥反应诊断有一定的辅助作用[3]。

我们回顾性观察分析使用DXH800全自动血细胞分析仪检测移植手术后患者血常规标本中的大血小板的准确性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例资料 对2021年8月24日至2021年9月11日在江西省人民医院使用DXH 800全自动血细胞分析仪进行血常规检查的器官移植患者共602例进行筛选，包括在器官移植科、器官移植科ICU住院的患者和在器官移植科门诊就诊的患者。筛选标准为：在近两年在我院器官移植科进行了肝或肾同种异体移植术，供受者血型相符，淋巴细胞毒实验阴性，群体反应性抗体阴性，HLA配型检测A、B、DR共3个位点，错配1～4个位点；截止至2021年9月11日，患者最后一次血常规结果中血小板计数＜100×10^9/L。

肾移植术后AR诊断标准：临床表现为尿量明显减少、血压升高、发热、移植肾区胀痛；实验室检查血肌酐明显升高；移植肾彩色多普勒超声检查移植肾各级动脉血管阻力指数升高（RI＞0.75）[4-5];移植肾穿刺活检病理符合Banff标准[6]。肝移植术后AR诊断标准：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）逐渐增高；彩色多普勒超声检测移植肝肝动脉血流信号明显减少且阻力指数升高，肝静脉频谱形态变化，波幅下降，频谱变钝[7-8]。

本研究共筛选观察分析对象37例，其中男性30例，女性7例，年龄28～64岁，平均年龄47.2岁。

1.2 仪器与材料 BECKMAN COULTER DXH800血细胞分析仪及配套的试剂和质控品；奥林巴斯光学显微镜；贝索瑞氏-吉姆萨复合染色液。

1.3方法 用EDTA抗凝管采集患者的静脉血2 ml，颠倒混匀5～10次后备用。标本检测严格按照血液分析仪操作规程进行操作并得到血小板计数结果和血小板直方图。将患者的静脉血推片使用瑞氏-吉姆萨复合染色液染色，通过显微镜观察血小板数量、形态，确定有无大血小板和巨血小板及其数量多少。

血小板数量的评估方法参照国际血液学复检专家组推荐的方法[9]：在油镜下，在血涂片分布良好的区域，一个血小板大约相当10*10^9/L的血小板计数量。每个血涂片在油镜下观察20个左右的视野，将每个视野下观察到的血小板数量进行统计并取平均值，作为该血液样本的血小板数量相对真实值。

2 结果

2.1 我们对上述筛选出的37份患者血小板计数<100×10^9/L的血常规结果进行观察分析，其中有13份标本的血小板直方图曲线出现异常，主要表现为直方图曲线不呈现为对数正态拟合曲线，占比35.1%。对此13份标本进行镜检观察和统计，见表1。 此13份标本中都观察到大血小板现象，平均每油镜视野0～3个大血小板。

表1 13例血小板直方图曲线异常标本的血小板仪器计数与镜检计数

2.2 对上述13位病例的病历、用药情况和检验结果进行分析，结果表明，13位患者之间均有高度的相似性，因此，我们从13位病例患者中选取1例进行病例分析。

该病例于2021年8月27日因腹部不适5年余，发现肝占位性病变1月余，我院以“肝炎后肝硬化失代偿期”收入器官移植科诊治。入院后，对患者进行各项体格检查，完善相关影像学检查和血液学检验，血小板计数166×10^9/L，血小板直方图无异常。于2021年08月27日进行肝移植。术后因供肝在重症医学科治疗过，有潜在感染机率，结合供体标本送检结果予以联合抗感染治疗，同时予以免疫抑制、改善贫血及低蛋白血症、改善凝血功能、预防血管栓塞、护肝、制酸护胃、化痰、支持等治疗。当日术后血小板计数下降至90×10^9/L，术后第二日（8月28日至9月6日）仪器血小板计数<100×10^9/L，9月10日血小板计数回升至187×10^9/L，期间仪器血小板计数结果变化，见图1。

图1 仪器血小板计数结果变化

通过观察，发现从8月29日至9月6日，血小板直方图有尾部抬高现象，以9月3日血常规结果为例，见图2。选取9月6日的血常规标本进行推片镜检，在油镜视野下可检见大血小板，见图3。平均每油镜视野可检见0～2个大血小板。该血常规标本中仪器血小板计数为70×10^9/L，通过推片镜检血小板计数相对真实值约为83×10^9/L，两次血小板计数结果存在较大差异。结合患者其他影像学检查和肝功能检查，ALT和AST明显升高，可以判断患者移植肝存在肝功能不全，患者存在一定的排斥反应。通过使用甲泼尼龙和他克莫司等抗排斥药物，9月10日患者肝功能基本恢复到正常水平，血小板数量恢复到正常水平，血小板直方图趋于正常。

图2 患者血常规结果及直方图

图3 患者血推片镜检结果

其他12位病例病史基本相似，在行移植术后，血小板数量下降至100×10^9/L以下，血小板直方图出现异常，尾部异常抬高，推片可发现大血小板，结合其他相关检查可断定存在AR反应。通过使用抗排斥药物后，可见移植物功能恢复良好，血小板数量和形态恢复至正常水平。

3 讨论

传统的显微镜直接镜检法由于对检验师技术水平要求高、操作时间长、计数重复性差等原因，目前已基本被血液分析仪法取代。不同品牌的血液分析仪其检测血小板的原理并不完全相同[10-12]，如日本希森美康XN-2000全自动血细胞分析仪检测血小板有两种方式，一种是基于于鞘流阻抗法的电阻抗法（PLT-I模式)，另一种则是基于流式细胞术、核酸荧光染色半导体激光法的光学法(PLTO模式)。而美国贝克曼库尔特DXH800全自动血细胞分析仪则有所区别，其检测血小板使用的原理为电阻抗法。在血小板数量大于100×10^9/L时系统将直方图呈现为对数正态拟合曲线图，并依据此图分析得出最终的血小板数量，见图4。当样本中的血小板数量小于20×10^9/L时，由于样本中的血小板数量极少，仪器无法计数到有统计意义数量的血小板，因此所形成的直方图是不规则的，见图5。仪器无法对血小板直方图进行拟合形成曲线，所得的血小板结果也就令人质疑，需要依靠检验人员参照病人的疾病信息判断仪器的结果是否可信。当样本中的血小板数量为20～100×10^9/L时，部分患者由于处于疾病状态，体内血小板的形态发生异常，其中一种异常类型为出现一定数量的大血小板，直径为4～7μm，或者巨血小板，直径常为7～20μm。在检测此类样本的血小板数量时，有一定数量的血小板可以通过仪器进行识别计数，形成血小板直方图，并进行数字化分析拟合形成一条曲线，但是该曲线并不符合对数正态分布的规则，见图6。从该图和本实验案例可知，当血小板的体积大于25 fl时，仪器会有报警信息，所形成的血小板直方图会产生尾部上翘的现象。

图4 血小板直方图图示

图5 血小板数量极少时的血小板直方图图示

图6 存在大血小板或巨血小板时的血小板直方图图示

通过人工推片镜检计数进行对比后可发现，在排除细胞碎片、小红细胞等干扰的情况下，仪器的血小板计数结果没有将大血小板或巨血小板计数在内，导致两者之间存在一定的差异，镜检血小板计数结果更高。因此，在DXH800血液分析仪检测分析出血小板计数结果低于100×10^9/L且直方图出现异常尾部上翘的现象时，进行人工复检修改血小板计数结果并备注有无大血小板或巨血小板存在是非常有必要的，有利于协助临床医生对患者病情进行更准确的诊断。

急性排斥反应作为排斥反应的一种，是最常见的排斥反应类型，多发生在移植术后早期，如不及时发现和处理，可导致移植物严重损害甚至失功。肾移植排斥反应分为两种，一种为移植肾组织间质内单个核炎性细胞浸润，肾小管上皮炎和血管内皮炎，另一种为移植肾实质内肾小球炎，动脉内膜炎甚至动脉管壁纤维素样坏死。因此，及时诊断AR是现阶段保证移植物长期存活的重要环节。对同种异体移植手术后早期发现和治疗AR的挑战在于检测和筛查移植物的排斥状态。肾移植术后AR的发生是一种炎症反应过程。Banff病理分类方法强调，移植肾动脉内膜炎是AR的基本病变[13]，而血小板的活化在移植肾动脉内膜炎的炎症反应过程中扮演重要角色[14]。肝移植术后对AR的监测，除了临床观察、生化及影像学检查外，主要依据移植肝活检组织病理，并采用Banff标准评分，评价方案主要观察项目为：汇管区炎症、胆管损伤、门静脉或肝静脉内膜炎[15]。文献表明，术前血小板计数小于49.5×10^9/L可能是肝移植受者不良预后的预测因素；血小板不仅参与止血和组织修复，还参与肝脏再生[16]。因此，血小板计数结果与临床肝、肾移植术后患者病情转归及预后息息相关。

在AR的初始阶段，活化的血小板产生各种细胞因子促进血小板与内皮细胞黏附[17]。血小板分泌血栓素A2和二磷酸腺苷共同参与微血栓形成，后者是AR过程中的关键环节[18]。除此之外，血小板活化后产生的鞘氨醇磷酸酯还可促进白细胞的活化和募集[19]。血小板活化释放活化标志物，AR发生时血小板活化标志物水平升高，升高的血小板活化标志物可被三磷酸核苷双磷酸水解酶(NTPDasel)抑制[20-22]。当血小板活化受到抑制后，其活化标志物CD61、CD63、PAC-1、PDGF-BB和TGF-β等表达明显减少，移植物功能趋于稳定[23]。

当机体因炎症反应出现血小板活化时，血小板（PLT)、血小板压积（PCT)下降，平均血小板体积（MPV）、血小板体积分布宽度（PDW）、大血小板比率（P-LCR）增加，体积大和差异程度高的血小板含有更多的颗粒和更高的活性[17]。付绍杰[18]等的研究也发现MPV、PDW和P-LCR可作为提示肾移植术后急性排斥反应过程中血小板活化的重要指标。近年有相关研究表明，肾移植功能延迟恢复作为肾移植患者常见并发症之一，血小板五项参数中的PDW、MPV和P-LCR对其有较高的预测价值，早期监测PDW、MPV和P-LCR对降低肾移植功能延迟恢复的发生率有重要意义[19-21]。

本文对病例的分析研究，与以上报道一致，验证了大血小板具有作为辅助评估移植术后急性排斥反应的潜在价值。通过对血液分析仪提供的血小板直方图，初步判断是否存在大血小板，利用手工推片进一步计算大血小板的数量，从而帮助临床更加及时了解AR的进展状况，指导临床使用抗AR药物。在其他疾病或特殊生理状态下，大血小板的生成也会增加，其中以妊娠、肿瘤以及心脑肾疾病多见，妊娠和恶性肿瘤所占比例最高[22]。在以上疾病中，大血小板增多都伴随血小板的减少，因此可以初步推断，大血小板为新生成的血小板，活性比正常血小板高，与疾病消耗破坏正常血小板有关。

综上所述，使用BECKMAN COULTER DXH800全自动血细胞分析仪对肾移植或肝移植的患者进行血常规检测时，应对血小板减少且血小板直方图异常的结果进行一定的重视，通过推片镜检的方式以确定是否存在大血小板，从而保证血常规检验结果的质量，为临床诊断排斥反应提供一定的辅助作用。